[發明專利]一種特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針及其原位熒光雜交檢測方法

在審

• 申請號: 201710210001.2
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106987630A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 李田;許晨;羅堿;徐金智;周澤揚
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

1.一種特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針，其特征在于，核酸探針序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

2.含有權利要求1所述核酸探針的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針由核酸探針和熒光染料組成，所述熒光染料結合在核酸探針的5’端或3’端。

3.根據權利要求2所述的熒光探針，其特征在于，所述熒光染料為Cy3、Cy5、FITC、FAM、Alexa Fluor 488或Biotin。

4.根據權利要求2所述的熒光探針，其特征在于，所述熒光染料為Cy3。

5.利用權利要求2所述的熒光探針特異性標記家蠶微孢子蟲的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述熒光原位雜交方法為以下步驟：

(1)用多聚甲醛對感染家蠶微孢子蟲的細胞進行固定，所述熒光探針用雜交液進行稀釋至終濃度為3～5ng/μL，于46℃進行雜交，雜交10～12小時，再用雜交清洗液清洗非特異性結合的探針，于48℃清洗1～4小時；

(2)用100ng/μL DAPI對細胞的細胞核以及家蠶微孢子蟲的細胞核進行標記，18～25℃染色30min，PBS清洗，封片，再用熒光顯微鏡，選取相應的激發波長觀測熒光探針標記結果。

6.根據權利要求5所述的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述細胞為家蠶胚胎細胞、家蠶卵巢細胞或草地貪夜蛾細胞。

7.根據權利要求5所述的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述細胞為家蠶胚胎細胞。

8.根據權利要求5所述的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述多聚甲醛的質量濃度為4％；雜交液為含有900mM NaCl,20mM Tris,0.01％SDS,PH值為7.5的水溶液；所述雜交清洗液為含有900mM NaCl,20mM Tris，0.01％SDS,5mM EDTA,PH值為7.5的水溶液。

9.根據權利要求5所述的熒光原位雜交方法，其特征在于，所述PBS清洗是用PBS清洗1～5次，每次5～10分鐘。