[發明專利]軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法及人源組織工程化再生軟骨

有效

• 申請號: 201710209310.8
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106967686B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 吳海濤
• 申請（專利權）人: 北昊干細胞與再生醫學研究院有限公司;冠昊生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/54;A61L27/38;A61L27/24
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;萬志香

本發明公開了一種軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法及人源組織工程化再生軟骨。通過在體外對軟骨細胞進行端粒酶mRNA轉染，使后續培養得到的軟骨細胞中端粒延長，并且在端粒酶mRNA的轉染與完全培養基中維生素C、B18R或p65i、雷帕霉素和白藜蘆醇等小分子化合物的協同作用下，可以顯著提高軟骨細胞尤其是老齡患者的軟骨細胞的增殖與活力，對于改善或治療衰老引起的細胞功能衰退，使其實際應用于再生醫學治療，具有重大意義。上述軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法使得軟骨細胞端粒的延長不是連續的甚至頻繁的，無基因組插入誘變風險，也無細胞永生化成瘤風險，在安全性和應用性上有了大大的提高，使之在再生醫學治療上有更好的應用。

技術領域

本發明涉及細胞生物學領域，尤其是涉及一種軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法及人源組織工程化再生軟骨。

背景技術

端粒是染色體末端的保護帽，其是由短的多重復的非轉錄序列(TTAGGG)及一些結合蛋白組成的特殊結構，能夠保護基因組的穩定性，防止丟失染色體末端的遺傳物質。細胞的不斷擴增會漸進性地影響端粒的長度。當端粒縮短到一定程度，其保護性將消失，進而引起細胞的老化和凋亡。

端粒酶是合成端粒并保持其長度的酶。端粒酶由兩部分組成，一個RNA模板亞單位即端粒酶mRNA組分和一個蛋白催化單位即端粒酶逆轉錄酶。并非所有的體細胞都有端粒酶。胚胎細胞活躍地表達端粒酶，但是當胚胎細胞分化到一定程度，便停止端粒酶的表達。成體中只有少數細胞被報道有端粒酶表達，比如精原細胞，激活的T細胞和一些干細胞。端粒酶的基因缺陷會造成早老癥等疾病，病人會有骨髓衰竭和粘膜疾病等癥狀，包括異常色素沉積，指甲營養不良，口腔白斑等。有研究證明端粒酶缺失的模型鼠身上重新導入端粒酶后，衰老的癥狀有被糾正的趨勢，包括腦部疾病和不孕等。因端粒與細胞衰老的關系，端粒學說也因此成為氧化應激、糖化、基因等眾多衰老學說中的一個，并成為抗衰老研究中的熱門課題。

傳統的將端粒酶基因導入細胞的DNA重組技術往往涉及到質粒和病毒。Bodar等用含端粒酶基因的載體轉染幾乎無端粒酶活性的人體細胞，發現端粒明顯延長、細胞分離增快、細胞衰老減緩(Bodar(1998)Science.279：349-352)。這種基因工程產品對安全性有很高的要求，包括雜菌、內毒素、質粒等污染物的去除，病毒自我復制能力的測定等，因而限制了其臨床使用；其次會造成基因的隨機插入，可能會引起基因組的不穩定性；最后，穩定表達端粒酶有造成細胞永生化的風險。這些不利因素影響端粒酶基因療法的臨床使用和市場化。

近年來，導入信使核糖核酸(mRNA)分子讓細胞表達基因成為了一種新的基因治療的手段被研究。由于mRNA直接在細胞質內被作為模板合成蛋白質，mRNA引入細胞后不會整合到基因組中從而影響遺傳物質的穩定性。而mRNA作為一種人類自身就擁有的遺傳物質，其安全性也比病毒要高。mRNA治療成為一個研究熱門，尤其是作為流感疫苗和腫瘤疫苗被研究。mRNA能夠引起長時間的強烈的針對流感病毒的保護性免疫。mRNA作為腫瘤疫苗也已經開展了I/II期臨床試驗，多數患者產生了針對腫瘤抗原的免疫反應。

隨著人們生活質量的提高，越來越多的人加入運動健身的行列，隨之而來的問題是運動損傷的患者越來越多，這其中軟骨損傷，尤其是膝、踝關節的軟骨損傷占很大比例。據國內外文獻報道，在膝關節鏡檢查的人群中，軟骨損傷的發病率在61％-68％之間。患者常感覺疼痛、僵硬，最終進展為重度關節炎，甚至無法行走，嚴重影響生活質量。

由于成熟的軟骨組織是無神經，無血管，無淋巴管的組織，并且軟骨細胞在軟骨組織中分布稀疏，造成軟骨組織的自我更新速度緩慢，自身修復能力有限。尤其是老年患者軟骨細胞增殖速度和自身修復能力都非常低，大大限制了老年軟骨損傷治療的應用。因此尋求合適的方法，體外增加軟骨細胞，尤其是老年患者軟骨細胞群體倍增次數，延緩細胞的老化，增加細胞活性，同時避免細胞永生化的可能，是進行軟骨修復治療的難點和重點。

發明內容