[發(fā)明專利]軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法及人源組織工程化再生軟骨

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710209310.8
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106967686B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳海濤
• 申請（專利權(quán)）人: 北昊干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究院有限公司;冠昊生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/54;A61L27/38;A61L27/24
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;萬志香

1.一種軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：制備具有如序列表中SEQ ID No.1所示cDNA序列對應(yīng)的RNA序列的端粒酶mRNA；

步驟二：將所述端粒酶mRNA在完全培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染傳代培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞，所述完全培養(yǎng)基是在DMEM/F12或RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血清、終濃度為5-50μg/ml的維生素C、終濃度為0.01-2μg/ml的B18R或p65i、終濃度為0.1-50ng/ml的雷帕霉素和終濃度為0.1-50μM的白藜蘆醇制備得到，所述血清是體積終濃度為1％-20％的人AB血清或體積終濃度為1％-20％的胎牛血清；

步驟三：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)使用所述完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

2.如權(quán)利要求1所述的軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于，在所述步驟一中，具體是：

以人基因組DNA或者攜帶人TERT基因的CDS區(qū)序列的質(zhì)粒作為模板，以序列表中SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示序列作為PCR引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，或者進(jìn)行序列全合成，獲得如SEQ ID No.4所示的人TERT基因的CDS區(qū)序列片段；

在得到的人TERT基因的CDS區(qū)序列片段的兩端分別連接上如SEQ ID No.5所示的3’UTR和如SEQ ID No.6所示的5’UTR；

在3’UTR后連接上如SEQ ID No.7所示的含poly A的序列，形成DNA片段5’UTR-TERTCDS-3’UTR-含polyA的序列；

將得到的DNA片段進(jìn)行線性化，然后在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA；

純化回收得到所述端粒酶mRNA。

3.如權(quán)利要求1所述的軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述人軟骨細(xì)胞是以用膠原酶消化軟骨組織后分離得到的P0代人軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)得到的P3代人軟骨細(xì)胞。

4.如權(quán)利要求3所述的軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于，在所述步驟二中，轉(zhuǎn)染時，所述人軟骨細(xì)胞的密度為40％-70％。

5.如權(quán)利要求4所述的軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于，在所述步驟二中，轉(zhuǎn)染時，加入的端粒酶mRNA的濃度為0.1-0.2μg/cm³。

6.如權(quán)利要求5所述的軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于，在所述步驟二中，轉(zhuǎn)染的具體步驟是：轉(zhuǎn)染時先將轉(zhuǎn)染試劑與轉(zhuǎn)染用減血清培養(yǎng)基混合制成混合液A，再將端粒酶mRNA用相應(yīng)的所述轉(zhuǎn)染用減血清培養(yǎng)基稀釋制成B，然后將A和B混合孵育，向P3代人軟骨細(xì)胞中加入所述完全培養(yǎng)基和上述A與B的混合物，混合均勻培養(yǎng)。

7.如權(quán)利要求6所述的軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法，其特征在于，還包括根據(jù)人軟骨細(xì)胞的密度，重復(fù)使用步驟二中的轉(zhuǎn)染方法再對轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞進(jìn)行一次或多次轉(zhuǎn)染的步驟。

8.一種人源組織工程化再生軟骨，其特征在于，包括膠原膜和如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的軟骨細(xì)胞體外端粒延長增殖培養(yǎng)的方法培養(yǎng)得到的端粒延長的人軟骨細(xì)胞；所述人軟骨細(xì)胞貼附在所述膠原膜上。

9.如權(quán)利要求8所述的人源組織工程化再生軟骨，其特征在于，所述人軟骨細(xì)胞是以濃度為1×10⁷-4×10⁷個人軟骨細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液按照1×10⁶-4×10⁶個人軟骨細(xì)胞/cm²的接種密度滴加接種至所述膠原膜上制備得到。

10.如權(quán)利要求9所述的人源組織工程化再生軟骨，其特征在于，所述細(xì)胞懸液中人軟骨細(xì)胞的存活率控制不低于80％，且在膠原膜上的貼附率不小于80％。