[發明專利]軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法及人源組織工程化再生軟骨

有效

• 申請號: 201710209310.8
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106967686B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 吳海濤
• 申請（專利權）人: 北昊干細胞與再生醫學研究院有限公司;冠昊生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/54;A61L27/38;A61L27/24
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;萬志香

1.一種軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：制備具有如序列表中SEQ ID No.1所示cDNA序列對應的RNA序列的端粒酶mRNA；

步驟二：將所述端粒酶mRNA在完全培養基中轉染傳代培養的人軟骨細胞，所述完全培養基是在DMEM/F12或RPMI1640基礎培養基中加入血清、終濃度為5-50μg/ml的維生素C、終濃度為0.01-2μg/ml的B18R或p65i、終濃度為0.1-50ng/ml的雷帕霉素和終濃度為0.1-50μM的白藜蘆醇制備得到，所述血清是體積終濃度為1％-20％的人AB血清或體積終濃度為1％-20％的胎牛血清；

步驟三：將轉染后的細胞繼續使用所述完全培養基進行培養。

2.如權利要求1所述的軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法，其特征在于，在所述步驟一中，具體是：

以人基因組DNA或者攜帶人TERT基因的CDS區序列的質粒作為模板，以序列表中SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示序列作為PCR引物序列進行PCR擴增，或者進行序列全合成，獲得如SEQ ID No.4所示的人TERT基因的CDS區序列片段；

在得到的人TERT基因的CDS區序列片段的兩端分別連接上如SEQ ID No.5所示的3’UTR和如SEQ ID No.6所示的5’UTR；

在3’UTR后連接上如SEQ ID No.7所示的含poly A的序列，形成DNA片段5’UTR-TERTCDS-3’UTR-含polyA的序列；

將得到的DNA片段進行線性化，然后在體外轉錄成mRNA；

純化回收得到所述端粒酶mRNA。

3.如權利要求1所述的軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法，其特征在于，在所述步驟二中，所述人軟骨細胞是以用膠原酶消化軟骨組織后分離得到的P0代人軟骨細胞進行傳代培養得到的P3代人軟骨細胞。

4.如權利要求3所述的軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法，其特征在于，在所述步驟二中，轉染時，所述人軟骨細胞的密度為40％-70％。

5.如權利要求4所述的軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法，其特征在于，在所述步驟二中，轉染時，加入的端粒酶mRNA的濃度為0.1-0.2μg/cm³。

6.如權利要求5所述的軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法，其特征在于，在所述步驟二中，轉染的具體步驟是：轉染時先將轉染試劑與轉染用減血清培養基混合制成混合液A，再將端粒酶mRNA用相應的所述轉染用減血清培養基稀釋制成B，然后將A和B混合孵育，向P3代人軟骨細胞中加入所述完全培養基和上述A與B的混合物，混合均勻培養。

7.如權利要求6所述的軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法，其特征在于，還包括根據人軟骨細胞的密度，重復使用步驟二中的轉染方法再對轉染后培養的人軟骨細胞進行一次或多次轉染的步驟。

8.一種人源組織工程化再生軟骨，其特征在于，包括膠原膜和如權利要求1-7中任一項所述的軟骨細胞體外端粒延長增殖培養的方法培養得到的端粒延長的人軟骨細胞；所述人軟骨細胞貼附在所述膠原膜上。

9.如權利要求8所述的人源組織工程化再生軟骨，其特征在于，所述人軟骨細胞是以濃度為1×10⁷-4×10⁷個人軟骨細胞/ml的細胞懸液按照1×10⁶-4×10⁶個人軟骨細胞/cm²的接種密度滴加接種至所述膠原膜上制備得到。

10.如權利要求9所述的人源組織工程化再生軟骨，其特征在于，所述細胞懸液中人軟骨細胞的存活率控制不低于80％，且在膠原膜上的貼附率不小于80％。