[發明專利]一種L-蘋果酸鈉的直接酶促轉化生產方法

在審

• 申請號: 201710208506.5
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN108660164A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 周鐵成;王云山;王自強;馮曉東;趙晶
• 申請（專利權）人: 懷來縣長城生物化學工程有限公司
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 董世豪;張淑珍

本發明公開了直接酶促轉化生產L?蘋果酸鈉的方法，該方法包括：以富馬酸和鈣鹽為原料，在延胡索酸水合酶的催化下生產L?蘋果酸鈣，然后經碳酸鈉中和后，制備得到L?蘋果酸鈉。本發明通過選擇性地克隆表達催化正向反應的延胡索酸水合酶的編碼基因片段，使上述反應平衡向L?蘋果酸鹽合成的方向偏移，同時采用鈣型底物進行催化，解決了底物殘留導致的產品質量問題，同時，作為副產物生成的碳酸鈣回收利用使得整個生產過程中無副產物排放，實現了原子的經濟性轉化，具有顯著的工業應用價值和環境效益。

技術領域

本發明涉及一種L-蘋果酸鈉的酶促轉化生產方法，屬于生物催化制備有機酸及其鹽的領域。

背景技術

L-蘋果酸鈉是DL-蘋果酸鈉的一種光學異構體，與DL-蘋果酸鈉相比，L-蘋果酸鈉可直接進入三羧酸循環參與人體的新陳代謝，具有重要的生理活性功能。在DL-蘋果酸鈉中，其含有的D-蘋果酸鈉是不具有生理活性的，需經過肝臟的消旋酶和腎臟的氧化還原酶作用，才可被機體利用，鑒于此，DL-蘋果酸鈉已被禁止在老年人、肝腎功能障礙患者及嬰幼兒食品中使用，從而避免D-蘋果酸鈉在人體內的殘留并由此減輕人體的代謝負擔。因此，生產單一旋光性的L-蘋果酸鈉已是必然趨勢。

然而，與DL-蘋果酸鈉的生產成本相比，目前商業化的L-蘋果酸鈉生產技術是通過將L-蘋果酸和碳酸鈉等進行中和反應來制備L-蘋果酸鈉，此過程存在如下缺點：(1)在此過程中生成大量的作為副產物的硫酸鈣，在酸解時消耗大量的硫酸，并且碳酸鈣的消耗量也較高；(2)采用L-蘋果酸進行中和反應來制備L-蘋果酸鈉時，由于作為原料的L-蘋果酸的價格較高，因此造成L-蘋果酸鈉的生產成本較高，從而制約了L-蘋果酸鈉的廣泛應用；(3)當上述過程中涵蓋L-蘋果酸的生產步驟時，由于該步驟涉及濃縮、結晶、干燥等環節，整體能耗較高。隨著生物催化技術的發展，采用酶促轉化工藝直接生產L-蘋果酸鈉已然成為未來的發展方向。

就目前的報道而言，涉及L-蘋果酸鈉酶促轉化工藝的現有技術(例如，中國專利申請CN200610161572.3；胡永紅等，反應分離耦合技術生產L-蘋果酸工藝過程的優化研究，《生物工程學報》，17卷5期，2001年9月)關注較多的是采用延胡索酸酶將底物富馬酸(也稱為延胡索酸)或其鹽轉化為L-蘋果酸的研究。其中，需要對反應中的作為中間產物生成的L-蘋果酸鹽(例如L-蘋果酸鈣)利用硫酸等強酸進行處理以得到產物L-蘋果酸。由于上述處理，使得通過L-蘋果酸的中和反應進一步生產L-蘋果酸鈉的成本較高。

另外，部分現有技術中提到了將底物富馬酸制成富馬酸鈉并通過延胡索酸酶的水合作用可生成蘋果酸鈉，但是由于該反應是可逆的，富馬酸鈉的平均轉化率低(≤70％)，目的產品(即，L-蘋果酸鈉)的濃度低，導致了終產物中的富馬酸鈉的含量過高，增加了后續的分離成本，而且對L-蘋果酸鈉的品質具有較大的不利影響(而高品質的L-蘋果酸鈉才是食品行業所需要的)。

因此，在本領域中，目前仍需要對L-蘋果酸鈉的酶促轉化工藝進行改進以降低生產成本(例如，不再采用L-蘋果酸作為反應原料)并提高產物的品質。基于本領域的現有技術存在的上述問題，在生產L-蘋果酸鈉時采用何種酶促轉化方法來同時滿足低生產成本和高產物品質的要求成為本發明關注的重點。

發明內容

本發明人通過深入的研究發現，當采用富馬酸和特定的鈣鹽作為原料時，中間產物L-蘋果酸鈣的沉淀有助于促進酶促反應向生成L-蘋果酸鈣這一中間產物的方向進行，從而提高了反應效率。而且，通過使L-蘋果酸鈣與碳酸鈉直接反應，不僅省略了生產得到L-蘋果酸的這一中間處理步驟，而且通過生成L-蘋果酸鈉溶液和作為沉淀物的碳酸鈣，從而可容易地將副產物碳酸鈣與本發明的期望產物L-蘋果酸鈉分離，并由此得到高品質的期望產物L-蘋果酸鈉，且作為副產物的碳酸鈣可隨后循環利用，藉此進一步降低了生產成本。