[發明專利]表達豬CD163分子鼠肺泡巨噬細胞系的建立及其應用

在審

• 申請號: 201710208459.4
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN107119019A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 周恩民;李亮亮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/00;C07K14/705;C12R1/91
• 代理公司: 西安長和專利代理有限公司61227
• 代理人: 黃偉洪

技術領域

本發明屬于生物學技術領域.，尤其涉及一種表達豬CD163分子鼠肺泡巨噬細胞系的建立及其應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一種豬的急性傳染病，該病給養豬業造成巨大的經濟損失。由于PRRSV具有遺傳變異性、嗜細胞性、且其致病機制仍然不清楚，目前用于分離，培養和研究PRRSV的細胞系主要是豬肺泡巨噬細胞 (PAM)和非洲綠猴腎細胞(Marc-145)。研究表明，PRRSV的細胞嗜性是由于宿主細胞表面的病毒受體決定的。目前研究發現豬CD163分子是PRRSV的一個主要細胞受體，能介導PRRSV的非易感細胞系變成PRRSV的易感細胞系。由于原代PAM細胞需要從剖殺豬的肺臟中獲取，致使獲取PAM的代價高，且不能保證不同批次之間的穩定性；由于Marc-145細胞來源于非洲綠猴，屬腎上皮細胞，非巨噬細胞，病毒感染后相關免疫指標無法評價，因此導致PRRSV體外研究受限，需要建立一個能夠替代PAM的細胞系用于PRRSV的分離，培養和感染后相關免疫指標等的評價。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種表達豬CD163分子鼠肺泡巨噬細胞系的建立及其應用。

本發明是這樣實現的，一種鼠肺泡巨噬細胞系，所述鼠肺泡巨噬細胞系為 MH-S^CD163，保藏號為：CCTCC NO:C2016167。

本發明的另一目的在于提供一種所述鼠肺泡巨噬細胞系的建立方法，所述鼠肺泡巨噬細胞系的建立方法包括以下步驟：

步驟一，以PB-CMV-CD163-EF1α-GFP-Puro質粒作為模板，根據慢病毒載體表達載體多克隆酶切位點的序列，設計CD163特異性引物，用BamHI和 XbaI將載體線性化，將CD163 cDNA克隆到表達載體，經過酶切和測序正確后，載體命名為pTrip-CMV-CD163-puro；

步驟二，將pTrip-CMV-CD163-Puro載體，psPAX2和pMD2.G共轉染 HEK293T細胞，轉染6h后，換成含3％血清的RPMI1640，60h后，收取含慢病毒的細胞上清，測定其滴度；

步驟三，棄去原有的10％血清的RPMI1640，將重組慢病毒按照1MOI/孔孵育MH-S細胞，加Polybrene 8ug/mL；病毒感染8h后，更換新培養基，繼續培養48h；細胞培養72h后，逐步加入含5μg/mL的嘌呤霉素的培養基篩選轉染的細胞；經過10天嘌呤霉素的篩選，并用96孔細胞板進一步亞克隆，經過2周培養，獲得穩定表達豬CD163的細胞系。

進一步，所述測定滴度后將MH-S^CD163細胞鋪入24孔板中，培養至匯合度為90％；

進一步，所述步驟三中每48h更換一次培養基，隨著陽性細胞比例的增加，嘌呤霉素的濃度適當地增加。

本發明的另一目的在于提供一種利用所述鼠肺泡巨噬細胞系表達的豬 CD163蛋白。

本發明的另一目的在于提供一種利用所述鼠肺泡巨噬細胞系分離和培養的 PRRSV。

本發明的另一目的在于提供一種利用所述鼠肺泡巨噬細胞系生產的PRRSV 病毒。

本發明的優點及積極效果為：通過在PAM細胞中擴增全長CD163分子 cDNA(GenBank登陸號：JX292263)。將其克隆到慢病毒表達載體，構建了表達豬CD163蛋白的真核表達載體。將該載體轉染至MH-S細胞系，通過嘌呤霉素篩選，獲得一株穩定表達豬源CD163分子的MH-S細胞系。本發明通過PRRSV SD16毒株感染實驗，發現該株細胞對PRRSV高度易感。PRRSV感染的毒價可以達到10⁵TCID₅₀/mL以上。細胞系在體外可以穩定傳到60代以上。通過構建 PRRSV易感的小鼠來源的肺泡巨噬細胞系，可以模擬PRRSV感染自然宿主細胞過程中的免疫情況，擴大研究范圍該株細胞系對PRRSV高度易感；細胞系可用于PRRSV的分離、培養、增殖以及研究PRRSV的免疫機制。

附圖說明

圖1是本發明實施例提供的表達豬CD163分子鼠肺泡巨噬細胞系的建立方法流程圖。

圖2是本發明實施例提供的MH-S^CD163細胞系CD163基因鑒定結果示意圖；