[發(fā)明專利]表達(dá)豬CD163分子鼠肺泡巨噬細(xì)胞系的建立及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710208459.4
• 申請(qǐng)日: 2017-03-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107119019A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周恩民;李亮亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/867;C12N7/00;C07K14/705;C12R1/91
• 代理公司: 西安長(zhǎng)和專利代理有限公司61227
• 代理人: 黃偉洪

1.一種鼠肺泡巨噬細(xì)胞系，其特征在于，所述鼠肺泡巨噬細(xì)胞系為MH-S^CD163，保藏號(hào)為：CCTCC NO:C2016167。

2.一種如權(quán)利要求1所述鼠肺泡巨噬細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，所述鼠肺泡巨噬細(xì)胞系的建立方法包括以下步驟：

步驟一，以PB-CMV-CD163-EF1α-GFP-Puro質(zhì)粒作為模板，根據(jù)慢病毒載體表達(dá)載體多克隆酶切位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)CD163特異性引物，用BamHI和XbaI將載體線性化，將CD163cDNA克隆到表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序正確后，載體命名為pTrip-CMV-CD163-puro；

步驟二，將pTrip-CMV-CD163-Puro載體，psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h后，換成含3％血清的RPMI1640，60h后，收取含慢病毒的細(xì)胞上清，測(cè)定其滴度；

步驟三，棄去原有的10％血清的RPMI1640，將重組慢病毒按照1MOI/孔孵育MH-S細(xì)胞，加Polybrene 8ug/mL；病毒感染8h后，更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h；細(xì)胞培養(yǎng)72h后，逐步加入含5μg/mL的嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；經(jīng)過(guò)10天嘌呤霉素的篩選，并用96孔細(xì)胞板進(jìn)一步亞克隆，經(jīng)過(guò)2周培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達(dá)CD163的細(xì)胞系。

3.如權(quán)利要求2所述的鼠肺泡巨噬細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，所述測(cè)定滴度后將MH-S細(xì)胞鋪入24孔板中，培養(yǎng)MH-S細(xì)胞至匯合度為90％。

4.如權(quán)利要求2所述的鼠肺泡巨噬細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，所述步驟三中每48h更換一次培養(yǎng)基，隨著陽(yáng)性細(xì)胞比例的增加，嘌呤霉素的濃度適當(dāng)?shù)卦黾印?/p>

5.一種利用權(quán)利要求1所述鼠肺泡巨噬細(xì)胞系表達(dá)的PRRSV細(xì)胞受體CD163蛋白。

6.一種利用權(quán)利要求1所述鼠肺泡巨噬細(xì)胞系分離和培養(yǎng)的PRRSV。

7.一種利用權(quán)利要求1所述鼠肺泡巨噬細(xì)胞系生產(chǎn)的PRRSV病毒。