[發明專利]利用喜樹懸浮細胞生產喜樹堿和10-羥基喜樹堿的方法

有效

• 申請號: 201710205026.3
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN107043795B
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發明（設計）人: 羅應剛;蒲祥;楊云;屈細興;陳菲;張國林
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N5/04
• 代理公司: 成都賽恩斯知識產權代理事務所(普通合伙) 51212
• 代理人: 高利丹

本發明涉及一種利用喜樹懸浮細胞生產喜樹堿和10?羥基喜樹堿的方法，屬于醫藥生物技術領域。本方法包括以下步驟：(1)將喜樹懸浮細胞細胞接種到MS液體培養基進行培養，培養過程中添加山梨糖醇；(2)收集相應的懸浮細胞和細胞培養液；(3)分離提取喜樹堿和10?羥基喜樹堿。本發明利用喜樹懸浮細胞獲得喜樹堿、10?羥基喜樹堿的方法簡單易控制，與傳統喜樹堿和10?羥基喜樹堿的制備方法相比，本發明采用山梨糖醇作為誘導因子能100～500余倍地提高喜樹堿和10?羥基喜樹堿產量。

技術領域

本發明涉及一種利用喜樹懸浮細胞生產喜樹堿和10-羥基喜樹堿的方法，屬于醫藥生物技術領域。

背景技術

喜樹(Camptotheca acuminate)，別名旱蓮、水栗、水桐樹、天梓樹、旱蓮子、千丈樹、野芭蕉、水漠子，是珙桐科、喜樹屬植物。主要分布于中國長江以南地區。1999年8月，經中華人民共和國國務院批準，喜樹被列為第一批國家重點保護野生植物，保護級別為Ⅱ級。

喜樹具有很好的藥用價值，其果實、樹皮、根、樹枝、葉均可用藥。現代研究表明，喜樹植物中主要藥用活性成分為生物堿。臨床多提取喜樹堿用于治療腫瘤等疾病。同時，喜樹堿類藥物也是目前臨床上常用的三大天然抗癌藥物之一。

喜樹堿最早從我國特有植物喜樹(Camptotheca acuminata)樹皮中分離獲得，后來陸續在多種植物中發現，如夾竹桃科的海木狗牙花(Ervatamia heyneana)、茶茱萸科的臭味假柴龍樹(Nothapodytes foetida)以及茜草科的短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)等。喜樹堿通過抑制拓撲異構酶I而發揮抗腫瘤活性。通過對喜樹堿構效關系研究，衍生出一系列化合物用于治療胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、子宮頸癌、胃癌和血液腫瘤等疾病，是全球抗腫瘤藥物市場上的主要品種。

喜樹堿的來源主要有：1)植物提取；2)化學合成。植物提取喜樹堿是目前采用的主要方式。然而，喜樹堿在植物中的含量較低(一般為0.1-0.2％左右，在新鮮樹葉中含量稍高，達0.4-0.5％)，其提取、分離、純化、制備過程繁瑣；另外產喜樹堿植物的生長周期均較長，并且喜樹堿的積累進程緩慢。單純從植物中提取勢必造成對植物資源和生態環境的巨大破壞。此外，提取過程中大量有機溶劑的使用導致環境污染。喜樹堿的化學合成是通過不同的建環方法，例如拆分法、不對稱氧化法等，多數方法存在路線過長，總產率過低等不足，較難實現工業化。總之，喜樹堿的來源有限，不能滿足市場需求(國際市場每年喜樹堿需求量3000kg，但是全球喜樹堿年產量僅600kg)，需要發現和研發替代資源及技術。

隨著植物細胞法的建立和運用，目前有很多研究通過該方法獲得目的產物以及高附加值的植物次生代謝產物。植物細胞培養法是在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養基中進行震蕩培養，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術。該方法具有以下優勢：1)不受地理、季節和氣候條件的限制；2)節省土地，降低成本，生產周期短，可大大提高經濟效益；3)可代替整體植株在工廠內連續生產所需產物；4)可通過添加抑制劑等使生物合成按照人的意志進行；5)可通過誘變篩選，獲得高產細胞株，并且可以進行特定的生物轉化獲得新的有用物質。

迄今已有關于通過培養喜樹懸浮細胞產喜樹堿的報道，并且通過不同的方法使喜樹堿含量得到一定的提高，但含量提高倍率較低，通常為3～10倍，如通過添加氮源于喜樹懸浮細胞的方法來提高喜樹堿的方法，提高倍數最高位3.4倍；或通過紫外照射提高喜樹懸浮細胞中喜樹堿的產量，提高倍數最高為11倍。這些研究充分表明利用懸浮細胞生產喜樹堿成為一種可能，并且采用懸浮細胞生產喜樹堿無疑是解決喜樹堿原料來源的綠色途徑。但還需尋找一種使喜樹堿、10-羥基喜樹堿含量提高更多的制備方法。

發明內容

針對現有通過喜樹懸浮細胞生產喜樹堿和10-羥基喜樹堿存在產物含量低的問題，本發明提供了一種通過在喜樹懸浮細胞的培養過程中添加誘導因子提高喜樹堿和10-羥基喜樹堿產量的方法。