[發(fā)明專利]一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710204763.1
• 申請(qǐng)日: 2017-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN106896229A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉仁榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西科技師范大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/532;G01N33/68
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1.一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，包括以下步驟：

1)包被待分析抗原的抗體；

2)加入待測(cè)樣品，混勻；

3)洗滌，而后加入標(biāo)記有化學(xué)發(fā)光劑的抗體，混勻；

4)洗滌，而后加入發(fā)光啟動(dòng)試劑，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度；

其特征在于：所述化學(xué)發(fā)光劑是多聚吖啶酯；步驟3)所述抗體是同時(shí)與多聚吖啶酯和所述抗原均具有抗原抗體反應(yīng)活性的雙特異性抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于所述多聚吖啶酯是以多聚賴氨酸或具有多個(gè)氨基的蛋白為載體，以吖啶酯為單體的多聚體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于所述多聚吖啶酯是通過以下方法制備的：取多聚賴氨酸與吖啶酯反應(yīng)，而后經(jīng)AKATA蛋白純化系統(tǒng)G15柱純化，即得到所述多聚吖啶酯。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于所述吖啶酯選自吖啶酯AE-NHS，吖啶酯DMAE-NHS，吖啶酯NSP-DMAE-NHS或吖啶磺酰胺內(nèi)鹽NSP-SA-NHS。

5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于所述多聚吖啶酯分子中，吖啶酯單體的數(shù)量大于20。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于步驟3)所述抗體是通過以下方法制備的：

A)取吖啶酯與載體蛋白偶聯(lián)，得到吖啶酯人工抗原，利用所述吖啶酯人工抗原免疫小鼠，而后取所述小鼠的脾細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞融合，篩選分泌抗吖啶酯單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞；

B)取分泌與所述抗原相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體的細(xì)胞株，從中篩選次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型細(xì)胞株；取步驟A)所得的分泌抗吖啶酯單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，從中篩選胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型細(xì)胞株；將所述次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷型細(xì)胞株與胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型細(xì)胞株融合，而后篩選分泌抗所述抗原/抗吖啶酯的雙特異性抗體的四源雜交瘤細(xì)胞；

C)培養(yǎng)步驟B)所得的四源雜交瘤細(xì)胞，收集所述雙特異性抗體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于步驟A)中所述雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗吖啶酯單克隆抗體的解離常數(shù)小于2×10^-8。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于步驟C)完成后繼續(xù)執(zhí)行步驟D)：分別制備所述抗原偶聯(lián)瓊脂糖親和柱和吖啶酯偶聯(lián)瓊脂糖親和柱，采用所述抗原/吖啶酯雙親和柱純化步驟C)所得的雙特異性抗體。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于所述分析方法的分析對(duì)象是蛋白質(zhì)，激素或微生物。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析方法，其特征在于該方法的分析對(duì)象是甲胎蛋白，該方法具體包括以下操作：取抗甲胎蛋白抗體4℃包被過夜，3％脫脂牛奶封閉半小時(shí)后洗板并拍干，而后加入100μL待測(cè)樣品，37℃保持1h，利用PBST溶液洗滌4次，而后分半加入50μL抗甲胎蛋白/抗吖啶酯雙特異性抗體、50μL多聚吖啶酯，混勻后于37℃保持1h，利用PBST溶液洗滌4次，而后以100μL/孔的量加入NaOH溶液或H₂O₂溶液，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度RLU。