[發明專利]一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法

在審

• 申請號: 201710204763.1
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106896229A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 劉仁榮
• 申請（專利權）人: 江西科技師范大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/532;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，包括以下步驟：

1)包被待分析抗原的抗體；

2)加入待測樣品，混勻；

3)洗滌，而后加入標記有化學發光劑的抗體，混勻；

4)洗滌，而后加入發光啟動試劑，檢測發光強度；

其特征在于：所述化學發光劑是多聚吖啶酯；步驟3)所述抗體是同時與多聚吖啶酯和所述抗原均具有抗原抗體反應活性的雙特異性抗體。

2.根據權利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于所述多聚吖啶酯是以多聚賴氨酸或具有多個氨基的蛋白為載體，以吖啶酯為單體的多聚體。

3.根據權利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于所述多聚吖啶酯是通過以下方法制備的：取多聚賴氨酸與吖啶酯反應，而后經AKATA蛋白純化系統G15柱純化，即得到所述多聚吖啶酯。

4.根據權利要求2或3所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于所述吖啶酯選自吖啶酯AE-NHS，吖啶酯DMAE-NHS，吖啶酯NSP-DMAE-NHS或吖啶磺酰胺內鹽NSP-SA-NHS。

5.根據權利要求2或3所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于所述多聚吖啶酯分子中，吖啶酯單體的數量大于20。

6.根據權利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于步驟3)所述抗體是通過以下方法制備的：

A)取吖啶酯與載體蛋白偶聯，得到吖啶酯人工抗原，利用所述吖啶酯人工抗原免疫小鼠，而后取所述小鼠的脾細胞與SP2/O細胞融合，篩選分泌抗吖啶酯單克隆抗體的雜交瘤細胞；

B)取分泌與所述抗原相對應的單克隆抗體的細胞株，從中篩選次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷型細胞株；取步驟A)所得的分泌抗吖啶酯單克隆抗體的雜交瘤細胞，從中篩選胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型細胞株；將所述次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷型細胞株與胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型細胞株融合，而后篩選分泌抗所述抗原/抗吖啶酯的雙特異性抗體的四源雜交瘤細胞；

C)培養步驟B)所得的四源雜交瘤細胞，收集所述雙特異性抗體。

7.根據權利要求6所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于步驟A)中所述雜交瘤細胞所分泌的抗吖啶酯單克隆抗體的解離常數小于2×10^-8。

8.根據權利要求6所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于步驟C)完成后繼續執行步驟D)：分別制備所述抗原偶聯瓊脂糖親和柱和吖啶酯偶聯瓊脂糖親和柱，采用所述抗原/吖啶酯雙親和柱純化步驟C)所得的雙特異性抗體。

9.根據權利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于所述分析方法的分析對象是蛋白質，激素或微生物。

10.根據權利要求1所述的一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，其特征在于該方法的分析對象是甲胎蛋白，該方法具體包括以下操作：取抗甲胎蛋白抗體4℃包被過夜，3％脫脂牛奶封閉半小時后洗板并拍干，而后加入100μL待測樣品，37℃保持1h，利用PBST溶液洗滌4次，而后分半加入50μL抗甲胎蛋白/抗吖啶酯雙特異性抗體、50μL多聚吖啶酯，混勻后于37℃保持1h，利用PBST溶液洗滌4次，而后以100μL/孔的量加入NaOH溶液或H₂O₂溶液，檢測發光強度RLU。