[發明專利]一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法

在審

• 申請號: 201710204763.1
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106896229A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 劉仁榮
• 申請（專利權）人: 江西科技師范大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/532;G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及化學發光免疫分析技術領域，進一步涉及在CLIA方法框架下對化學發光劑的優化和被標記抗體的結構改良，具體涉及一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法。

背景技術

化學發光標記免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)，是將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術。CLIA是繼放免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析之后發展起來的一項最新免疫測定技術。化學發光標記免疫分析包含兩個部分，即免疫反應系統和化學發光分析系統，免疫反應系統是利用抗原與抗體的特異性結合原理，特異性的識別待分析物，化學發光分析系統則是利用化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發態的中間體,當這種激發態中間體回到穩定的基態時,同時發射出光子(hM)，利用發光信號)測量儀器可測量光量子產額。將發光物質(可在反應劑激發下生成激發態中間體直接標記在抗原或抗體上，抗體與待測分析物特異性結合，再加入催化劑或氧化劑，通過測定發光強度就可特異性測定待測分析物。

化學發光標記免疫分析是通過化學發光物(吖啶酯類化合物等)共價偶聯標記抗原或抗體，經起動發光試劑(NaOH、H₂O₂等)作用而發出強閃光的化學發光免疫分析方法。根據取代基的不同，常用作化學發光標記物的吖啶酯類化合物分為兩類：吖啶酯和吖啶磺酰胺。它們的結構中都有共同的吖啶環。它們的發光機理相同：在堿性H₂O₂溶液中，分子受到過氧化氫離子進攻時，生成不穩定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解為CO₂和電子激發態的N-甲基吖啶酮，當其回到基態時發出最大發射波長為430nm的光子。這類化合物從發光的機理來說特點是：①發光反應中在形成電子激發態中間體之前，聯結于吖啶環上的不發光的取代基部分從吖啶環上脫離開來，即未發光部分與發光部分分離，因而其發光效率基本不受取代基結構的影響。②吖啶酯或吖啶磺酰胺類化合物化學發光不需要催化劑，在有H₂O₂的稀堿性溶液中即能發光。因此應用于化學發光檢測具有許多優越性。吖啶酯類化合物作為標記物用于免疫分析具有非特異性結合少、與大分子偶聯不影響光量和光強度高等特點。

CLIA方法化學反應簡單、靈敏度高、快速、無須催化劑，檢測小分子抗原采用競爭法，檢測大分子抗原則采用夾心法。傳統的雙抗體夾心CLIA方法的工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和吖啶酯標記抗體(液相抗體)分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個不同的抗原決定簇結合，形成固相抗體-抗原-吖啶酯標記抗體免疫復合物。由于反應系統中固相抗體和吖啶酯標記抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在方法可檢測范圍內)。測定復合物的發光強度，即可確定待測抗原含量。

然而，Weeks等在發明CLIA方法時就發現：在雙抗體夾心CLIA中，抗體上偶聯標記的吖啶酯的量不能太高(n<2.8)，否則易造成抗體失活；Hage研究也發現，當提高吖啶酯與抗甲狀旁腺激素抗體反應的比例時(2.5μg：50μg)，有72％以上的抗體失活，當這一比例降到0.625μg:50μg時，仍有30％的抗體失活，需采用親和柱純化未失活抗體，操作繁瑣、重復性不好。在這種情況下，現有技術中以吖啶酯為發光物的化學發光免疫分析方法普遍僅能在抗體上偶聯低劑量的吖啶酯，這導致了檢測過程中發光信號的強度較低、直接影響了檢測的靈敏性。此外，現有技術中常規的吖啶酯類化合物單位劑量發光水平仍有待提升，如果能在保證抗體結合性能的基礎上通過結構改進以提升其化學發光水平，無疑將提升檢測的靈敏性。

發明內容

本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，以解決現有技術以吖啶酯為發光物的雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法中，抗體上無法結合較高劑量的吖啶酯類化合物從而制約了檢測靈敏性的技術問題。

本發明要解決的另一技術問題是現有技術以吖啶酯為發光物的雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法中，常規的吖啶酯類化合物其發光水平有待提升。

本發明要解決的再一技術問題是現有技術的雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法檢測靈敏性較低。

為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：

一種雙抗體夾心型化學發光標記免疫分析方法，包括以下步驟：

1)包被待分析抗原的抗體；