[發明專利]利用野生酸棗內生菌發酵生產皂甙類和黃酮類的方法

在審

• 申請號: 201710204167.3
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN107119101A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 鄧振山
• 申請（專利權）人: 延安大學
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20;C12P17/06;C12R1/07
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙)11491
• 代理人: 郭偉紅

技術領域

本發明涉及野生酸棗加工和皂甙類和黃酮類的生產技術領域，尤其涉及的是一種利用野生酸棗內生菌發酵生產皂甙類和黃酮類的方法。

背景技術

酸棗[Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow.]為鼠李科棗屬的一種灌木或小喬木，種仁、果肉、葉和根均可入藥，能起到鎮靜安神、斂汗生津、養肝寧心的作用，廣泛分布于我國中、北部地區，抗逆性強，是一種耐旱、耐寒、耐鹽堿的野生藥用植物，并且具有較高經濟價值和藥用價值的野生果樹資源。中醫典籍《神農本草經》中記載，酸棗可以“安五臟，輕身延年”，酸棗仁用于虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴、是一種廣受人們認可的安神藥物。酸棗仁皂苷A、B、B1(jujuboside A、B、B1)較早從酸棗仁的甲醇提取液中分離出的3個中性皂苷。近年，運用多種色譜和波譜方法(IR,UV,MS,NMR)分離鑒定出酸棗仁皂苷E、D、H(jujuboside E、D、H)及一種新羽扇豆烷型三萜化合物，命名為羅珠子酸甲酯(alphitolic acid methylester)。近年酸棗仁生物堿及脂肪酸類成分研究也有新進展，如從酸棗仁中分離出環肽類生物堿jubanine。較早報道的黃酮類為黃酮苷Spinosin和Zivulgarin。目前對酸棗的研究多集中于果仁部分，并發現與酸棗仁寧心安神功效發揮密切相關的物質可能為其所含有的三萜皂苷類、黃酮類及環肽類生物堿等化學成分，而對酸棗其他組織的研究報道國內外報道均較少。目前僅劉東、高振峰等分別從山西酸棗體內分離獲得76株內生細菌和40株內生真菌，吳家飛等從南酸棗(Choerospondias axillaris)中分離到一株對芒果炭疽病菌拮抗作用較強的菌株WYG5，有關酸棗內生菌的研究目前尚未見報道。迄今為止，有眾多學者對酸棗進行過一些研究，但主要集中在酸棗仁的化學成分和藥理藥效方面，而少見關于酸棗產藥用活性成分內生菌的報道，鑒于藥用植物內生菌具有潛在的重要應用價值，為尋找植物內生菌產生與宿主植物相同或相似有效成分。酸棗資源是有限的，人們對它的過度利用已經對生態環境造成了破壞，利用酸棗內生菌發酵產生與宿主有相同或相似藥用價值的成分，既可以節約藥材，保護生態環境，降低生產成本，還可以彌補季節性的缺陷，實現循環可持續地生產。

工業上目前傳統的制備酸棗仁總皂苷的方法主要是提取技術，主要有熱回流提取法、超聲提取法、高速逆流色譜分離法及酶法提取等，這些方法的主要弊端在于所得酸棗仁總皂苷純度低、提取能耗大、有機溶劑對環境污染嚴重等。從酸棗仁中提取分離總黃酮類物質的方法均為萃取法。如：藥材先用石油醚或乙醚索式提取法脫脂后，用甲醇或70％乙醇加熱回流提取，再用乙酸乙脂或正丁醇萃取得總黃酮，目前所使用的技術中采用萃取法從酸棗仁中提取分離總黃酮類物質，不但重現性不好，而且提取物中雜質較多，黃酮含量不高。用現有技術制備獲得的皂甙類和黃酮類工藝復雜，成本高，如何才能有效地解決上述現有技術的缺陷，開發研究出一種具有產業化前景、生產工藝簡單、經濟效益良好、無二次污染等特點的綠色、環境友好型的全新皂甙類和黃酮類生產和制備技術是一個亟待解決的問題。

發明內容

為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供利用野生酸棗內生菌發酵生產皂甙類和黃酮類化合物的方法，該方法采用微生物發酵方法制備皂甙類和黃酮類，與傳統的通過酸棗等提取的方法相比，工藝簡單，成本低，不發生結構異化，完整地保持了皂甙類和黃酮類有效成分的原有化學結構和優良藥效；采用野生酸棗內生菌發酵法制備皂甙類和黃酮類，微生物培養所用的營養基質是工業生產的副產物，既可以使廢棄物得到有效利用，又能帶來較大的經濟效益；反應快捷、產物污染小、途徑新，目前尚未有利用野生酸棗內生菌發酵的方法來制備皂甙類和黃酮類的報道。

為達到上述目的，本發明的技術方案為：

一種利用野生酸棗內生菌發酵生產皂甙類和黃酮類的方法，包括如下步驟：選取從野生酸棗內提取純化的芽孢桿菌(uncultured Bacillus sp.)，GenBank登錄號：KY393358；

步驟(1)菌種活化

將在4℃下保存的所述芽孢桿菌菌株由斜面轉接到固體培養基中，30℃下，在恒溫培養箱培養12～20h；

步驟(2)制備種子液

取上述經活化后的菌種，接種到種子培養基中(裝液量100mL/500mL三角瓶)，搖床轉速180r/min，30℃震蕩培養12～20h。

步驟(3)發酵