[發(fā)明專利]利用野生酸棗內生菌發(fā)酵生產皂甙類和黃酮類的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710204167.3
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN107119101A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發(fā)明（設計）人: 鄧振山
• 申請（專利權）人: 延安大學
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20;C12P17/06;C12R1/07
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙)11491
• 代理人: 郭偉紅

1.一種利用野生酸棗內生菌發(fā)酵生產皂甙類和黃酮類的方法，其特征是，其步驟如下：選取從野生酸棗內篩選的芽孢桿菌(uncultured Bacillus sp.)，GenBank登錄號：KY393358；

步驟(1)菌種活化

將在4℃下保存的所述芽孢桿菌菌株由斜面轉接到固體培養(yǎng)基中，30℃下，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～20h；

步驟(2)制備種子液

取步驟(1)中經活化后的菌種，接種到種子培養(yǎng)基中，搖床轉速180r/min，30℃震蕩培養(yǎng)12～20h；

步驟(3)發(fā)酵

將步驟(2)中種子液按體積分數(shù)2％～4％的接種量接入到裝有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵，裝料系數(shù)0.75，控制溫度28～31℃，pH 7.0～7.2，保持溶氧飽和度12％以上，培養(yǎng)5d，收集發(fā)酵液；

步驟(4)皂甙類和黃酮類的精制

將步驟(4)中的含皂甙類和黃酮類的發(fā)酵液組分經過離心、過濾、醇沉、萃取、低壓濃縮、層析、結晶和干燥后得到高純度的皂甙類和黃酮類。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，按照質量體積比，固體培養(yǎng)基的組成為：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH₄NO₃，0.5％KH₂PO₄，0.01％MgSO₄，1.5％瓊脂，其余為水。pH 7.0～7.2，115℃滅菌25min。

3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，按照質量體積比，固體培養(yǎng)基的組成為：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH₄NO₃，0.5％KH₂PO₄，0.01％MgSO₄，其余為水。pH 7.0～7.2，115℃滅菌25min。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，按照質量體積比，固體培養(yǎng)基的組成為：1％～6％葡萄糖，0.06％NH₄NO₃，0.5％KH₂PO₄，0.01％MgSO₄，其余為水。pH 7.0～7.2，115℃滅菌25min。發(fā)酵溫度28～31℃，通氣量0.7-0.9:1(V:V)，攪拌速度180-190r/min，pH 7.0～7.2。

5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，菌種接種到種子培養(yǎng)基中的裝液量為100mL/500mL三角瓶。

6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，離心、過濾、醇沉、萃取、低壓濃縮、層析、結晶和干燥具體操作為：將發(fā)酵液收集后，經4000r/min高速離心15min，分為菌體和發(fā)酵液兩部分，過濾得到的菌體采用體積分數(shù)60％乙醇，210W超聲浸提30min，過濾、收集浸提液，再經真空抽濾，合并過濾的發(fā)酵液和浸提液，50℃減壓濃縮，去除乙醇；用乙酸乙酯萃取，濃縮后于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫蝗∩鲜鲆宜嵋阴ポ腿∥铮由僭S甲醇使之溶解，樣品溶于熱乙醇中，配置濃度為1mg/ml上樣液，并加入5ml氯化鈉；取30ml上樣液以2ml/min的流速通過樹脂層并浸泡樹脂2h，用濃度為95％、65％的乙醇在2ml/min的流速下分別對乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏進行洗脫，收集洗脫液，在60℃水浴鍋蒸餾除去溶劑得到固體并烘干至粉末；上5inner diameter×130cm硅膠柱，用體積比為9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脫，并收集洗脫產物再用Sephadex LH-20，以甲醇作為流動相洗脫，進行進一步純化并結晶。

7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，本發(fā)明中皂甙類和黃酮類的測定方法：

HPLC分析的檢測條件為:黃酮類檢測：色譜柱為Kromasil C18，5μm,4.6mm×150mm；流動相：甲醇：0.2％磷酸＝50:50(v/v)；流速：0.8ml/min；檢測波長：260；柱溫：25℃；進樣量：10μL；皂苷類檢測：色譜柱為Kromasil C18，5μm,4.6mm×150mm；流動相：乙腈：水＝2:3(v/v)；流速：1ml/min；檢測波長：204；柱溫：35℃；進樣量：10μL。