[發(fā)明專利]一種小黃魚和大黃魚幼魚的PCR鑒定方法及引物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710204070.2
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN106884053A
• 公開（公告）日: 2017-06-23
• 發(fā)明（設計）人: 劉洋;蔡珊珊;韓志強
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司33109
• 代理人: 尉偉敏,趙越劍

技術領域

本發(fā)明涉及一種物種的鑒定方法，特別涉及一種小黃魚和大黃魚幼魚的PCR鑒定方法及引物。

背景技術

小黃魚(Larimichthys polyactis)和大黃魚(Larimichthys crocea)均隸屬于鱸形目、鱸亞目、石首魚科、黃魚屬，都曾是我國有名的四大海產。大黃魚和小黃魚體型相似，一般通過尾柄長與尾柄高比值進行區(qū)分，但對于大黃魚和小黃魚幼魚，小黃魚和大黃魚在幼魚階段形態(tài)十分相近，由于體型小，量度特征進行種類鑒定存在較大誤差，且僅從外部形態(tài)上區(qū)分這兩個物種是十分困難的，不利于種質資源的保護。

為了準確評估大黃魚資源，建立一種小黃魚和大黃魚幼魚的快速鑒定方法十分必要。種質資源的鑒別除傳統(tǒng)的形態(tài)分類學方法外，另有生物化學及基因指紋相關方法。其中尤以基因指紋方法應用廣泛，見于各種刑偵、醫(yī)學、科研等領域，特別是在科研中應用于各類形態(tài)相似物種的區(qū)別與鑒定。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于一種小黃魚和大黃魚幼魚的PCR鑒定方法，簡便易行，特異性高，可以清楚地鑒別區(qū)分形態(tài)相似的小黃魚和大黃魚幼魚。

本發(fā)明還提供了用于鑒定小黃魚和大黃魚幼魚的引物，特異性強。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種小黃魚和大黃魚幼魚的PCR鑒定方法，所述PCR鑒定方法步驟為：提取樣品的基因組DNA，采用鑒定引物對提取的DNA進行PCR擴增，PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現一條擴增條帶的為小黃魚，出現兩條擴增條帶的為大黃魚；所述鑒定引物序列如下：

COI-F：5’-GTTACGGCACATGCYTTCGT-3’

COI-R1：5’-GGAAACACCTGCGAGGTGTA-3’

COI-R2：5’-TARAGGATGGGATCGCCTCC-3’。

本發(fā)明采用分子生物學手段，對小黃魚和大黃魚幼魚的基因進行提取和篩選，從而將小黃魚和大黃魚幼魚這兩個不同物種區(qū)分開來，方法簡便易行，特異性高。本發(fā)明采用特異的引物擴增小黃魚和大黃魚幼魚的DNA，然后進行凝膠電泳分析，可以將兩者的DNA顯著區(qū)分開，從而可以將形態(tài)相似的小黃魚和大黃魚幼魚也區(qū)分開。

小黃魚樣品在500bp位置擴增出一條帶，而大黃魚樣品在300bp和500bp處各出現一條亮帶，通過帶型不同可以快速鑒別小黃魚和大黃魚幼魚樣品。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增體系為：10×buffer 2.5μl，dNTP 2μl，COI-F 1μl，COI-R1 1μl，COI-R2 1μl，Taq酶0.15μl，DNA模板1μl，ddH₂O補足體系至25μl。

作為優(yōu)選，dNTP的終濃度為0.8mM，COI-F的終濃度為1μM，COI-R1的終濃度為1μM，COI-R2的終濃度為1μM，Taq酶終濃度為0.04U/μl。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增條件為：94℃預變性3min，后經過40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃45s，50℃45s，72℃45s；最后72℃延伸10min。

一種用于鑒定小黃魚和大黃魚幼魚的引物，包括三條特異性引物，引物序列如下：

COI-F：5’-GTTACGGCACATGCYTTCGT-3’(SEQ ID No.1)

COI-R1：5’-GGAAACACCTGCGAGGTGTA-3’(SEQ ID No.2)

COI-R2：5’-TARAGGATGGGATCGCCTCC-3’(SEQ ID No.3)。

其中，混合堿基：R表示A+G，Y表示C+T。

本發(fā)明的有益效果是：簡便易行，特異性高，可以清楚地鑒別區(qū)分形態(tài)相似的小黃魚和大黃魚幼魚。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的凝膠電泳圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。

實施例：

一、采用酚/氯仿方法進行DNA提取：對用95％酒精或-20℃冷凍保存的小黃魚和大黃魚樣品，取背部肌肉組織50-100mg，采用傳統(tǒng)法(酚/氯仿抽提法)從提取基因組DNA。

詳細方法和步驟如下：