[發明專利]一種交叉淋巴毒實驗的方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201710203781.8
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN108663512A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 楊正林;劉小琦
• 申請（專利權）人: 四川省人民醫院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/569
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明公開了一種交叉淋巴毒實驗的檢測方法，它包含如下步驟：(1)取移植供者靜脈抗凝全血以及移植受者的血清，從移植供者靜脈抗凝全血中分離供者淋巴細胞；(2)取供者淋巴細胞液，染色標記，調整細胞濃度；(3)取凍干補體，溶解；(4)取5支反應管，依次加入供者淋巴細胞、生理鹽水、陽性血清、受者血清這4種試劑中的2種或者3種，混勻，靜置，再加入第5種試劑兔補體，再混勻，靜置；(5)染色，上樣。本發明還公開了一種交叉淋巴毒實驗的檢測試劑盒。本發明方法和試劑盒的毒性低、成本低廉，檢測準確度高，臨床應用前景優良。

技術領域

本發明涉及一種交叉淋巴毒實驗的方法和試劑盒。

背景技術

交叉淋巴細胞毒實驗即補體依賴的細胞毒實驗(CDC)，用于同種異體器官移植前，判斷受者對供者有無預存抗體。受者體內預存抗體可能由于多次輸血、妊娠、二次移植等原因產生。如果受者體內有細胞毒抗體，可能在移植后引起超急性排斥反應，造成移植失敗，因此在移植前檢查受者血清中有無抗供者淋巴細胞抗體，是預防超急性排斥反應所必需的實驗。

1969年,Patel和Terasaki發明了補體依賴的細胞毒實驗技術,用于腎移植前急性和超急性排斥反應的篩查,直到今天,交叉淋巴細胞毒實驗一直是移植前檢查供體特異性抗HLA抗體的金標準。該實驗技術也經歷了許多改進，如抗人球蛋白-補體依賴性細胞毒法(AHG-CDC)以及除去血清中的IgM、利用流式細胞技術標記補體等方法改進實驗的靈敏度和準確性。

目前最常用的交叉淋巴細胞毒實驗是熒光染色檢測方法，其原理是：供者活性淋巴細胞與受者血清共同孵育時，如果受者血清含有針對供者活性淋巴細胞特異性抗HLA循環抗體，則抗體上的結合到淋巴細胞抗原上形成抗原抗體復合物，在加入兔補體后激活一系列補體成分，導致淋巴細胞破壞死亡呈陽性反應。當加入熒光染色劑(含有丫啶黃與溴化乙啶)時，在熒光顯微鏡下活的淋巴細胞染成綠色，死亡淋巴細胞染成紅色。

熒光染色檢測方法通常通過微孔板法，所用材料為Terasaki微孔板，需要倒置熒光顯微鏡觀察判斷，存在如下3個缺陷：1、Terasaki微孔板為特制反應板，反應體系空間有限，不利于各實驗組分的充分混合，反應，同時還容易造成在計數時由于細胞重疊帶來計數和分型上的誤差；2、倒置熒光顯微鏡價格昂貴，開展此項目檢查的醫院需花費幾十萬購買，限制了該實驗方法的開展；3、采用的熒光染液含溴化乙啶，溴化乙啶具有致癌性，長時間使用可能會導致癌癥的發生。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種新的交叉淋巴細胞毒實驗的方法和檢測試劑盒。

本發明交叉淋巴毒實驗的檢測方法，步驟如下：

(1)取移植供者靜脈抗凝全血以及移植受者的血清，從移植供者靜脈抗凝全血中分離供者淋巴細胞；

(2)取供者淋巴細胞液，染色標記，調整細胞濃度；

(3)取凍干補體，溶解；

(4)取5支反應管，按照下表依次加入前4種試劑中的2種或者3種，混勻，靜置，再加入第5種試劑兔補體，再混勻，靜置；

(5)染色，上樣：

每管加入臺盼藍染色液或者中性紅染色液，反應，將染好色的反應產物加入定量分析板中，用光學顯微鏡觀察結果。

步驟(1)中，分離供者淋巴細胞的方法是：取移植供者靜脈抗凝全血，加入生理鹽水稀釋，然后加入裝有淋巴細胞分離液的試管內離心，吸取白膜層，加入PBS溶液混勻洗滌，離心，去上清，再加入PBS溶液混勻洗滌，離心，去上清，加入PBS溶液懸浮，即可。

優選地，所述生理鹽水以及前兩次PBS溶液用量與抗凝全血等體積；最后一次PBS溶液為抗凝全血體積的0.05倍；所述離心的轉速是

1500～1800RPM。