[發(fā)明專(zhuān)利]一種交叉淋巴毒實(shí)驗(yàn)的方法和試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710203781.8
• 申請(qǐng)日: 2017-03-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108663512A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊正林;劉小琦
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 四川省人民醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/558
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/558;G01N33/569
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種交叉淋巴毒實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟如下：

(1)取移植供者靜脈抗凝全血以及移植受者的血清，從移植供者靜脈抗凝全血中分離供者淋巴細(xì)胞；

(2)取供者淋巴細(xì)胞液，染色標(biāo)記，調(diào)整細(xì)胞濃度；

(3)取凍干補(bǔ)體，溶解；

(4)取5支反應(yīng)管，按照下表依次加入前4種試劑中的2種或者3種，混勻，靜置，再加入第5種試劑兔補(bǔ)體，再混勻，靜置；

(5)染色，上樣：

每管加入臺(tái)盼藍(lán)染色液或者中性紅染色液，反應(yīng)，將染好色的反應(yīng)產(chǎn)物加入定量分析板中，用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(1)中，分離供者淋巴細(xì)胞的方法是：取移植供者靜脈抗凝全血，加入生理鹽水稀釋?zhuān)缓蠹尤胙b有淋巴細(xì)胞分離液的試管內(nèi)離心，吸取白膜層，加入PBS溶液混勻洗滌，離心，去上清，再加入PBS溶液混勻洗滌，離心，去上清，加入PBS溶液懸浮，即可。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述生理鹽水以及前兩次PBS溶液用量與抗凝全血等體積；最后一次PBS溶液為抗凝全血體積的0.05倍；所述離心的轉(zhuǎn)速是1500～1800RPM。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(2)中，所述染色采用臺(tái)盼藍(lán)染色液或者中性紅染色液染色；所述染色液的用量與細(xì)胞液等體積；調(diào)整細(xì)胞液中的細(xì)胞濃度為2×10⁹個(gè)/L。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(3)中，所述補(bǔ)體為兔補(bǔ)體；所述凍干補(bǔ)體用水溶解，置于2-5℃下放置20min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(4)中，在供者淋巴細(xì)胞的加入量為5μl的情況下，各個(gè)試劑的加入量如下表：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(5)中，每管加入臺(tái)盼藍(lán)染色液或者中性紅染色液2ul，反應(yīng)5分鐘后將10ul染好色的反應(yīng)產(chǎn)物加入Fast Read定量分析板中，用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(5)中，用光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，陰性淋巴細(xì)胞為邊緣整齊、光亮、未染色細(xì)胞；陽(yáng)性細(xì)胞為邊緣不齊、藍(lán)色細(xì)胞，再進(jìn)一步計(jì)算死細(xì)胞的百分率來(lái)判斷陰性結(jié)果還是陽(yáng)性結(jié)果：如果陽(yáng)性細(xì)胞百分率在0—10％，1分，為陰性；11—20％，2分，陰性；21—50％，4分，弱陽(yáng)性；51—80％，6分，陽(yáng)性；81—100％，8分，強(qiáng)陽(yáng)性。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟(5)中，細(xì)胞對(duì)照、補(bǔ)體對(duì)照、血清對(duì)照的陽(yáng)性細(xì)胞百分率應(yīng)小于10％，陽(yáng)性對(duì)照的陽(yáng)性細(xì)胞百分率大于50％。

10.一種交叉淋巴毒實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包含淋巴細(xì)胞分離液、細(xì)胞計(jì)數(shù)板空白板、兔補(bǔ)體、陽(yáng)性血清、臺(tái)盼藍(lán)染色液或者中性紅染液、PBS緩沖液以及生理鹽水，當(dāng)淋巴細(xì)胞分離液的溶液為50ml時(shí)，其余成分的用量為：