[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)T?NOS終止子的RPA引物、試劑盒及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710202817.0
• 申請(qǐng)日: 2017-03-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106868181A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉華;唐雪明;白藍(lán);鄭思英;王金斌;蔣瑋;吳瀟;潘愛(ài)虎;賈軍偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海開(kāi)祺知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司31114
• 代理人: 費(fèi)開(kāi)逵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因安全生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)T-NOS終止子的RPA引物、試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展，目前，在我國(guó)已經(jīng)有多個(gè)轉(zhuǎn)基因作物品系進(jìn)入安全評(píng)價(jià)階段，申請(qǐng)商業(yè)化種植。

與此同時(shí)，因轉(zhuǎn)基因作物擴(kuò)散引起的安全性問(wèn)題受到了公眾的廣泛關(guān)注。為保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，落實(shí)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度、防止轉(zhuǎn)基因作物未經(jīng)安全批準(zhǔn)進(jìn)入生產(chǎn)流通環(huán)節(jié)，迫切需要建立快速簡(jiǎn)便的核酸檢測(cè)方法，用于市場(chǎng)監(jiān)管和例行監(jiān)測(cè)。

而在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中，目前，常規(guī)PCR檢測(cè)方法存在操作繁瑣、成本高、單一性等問(wèn)題，不能適應(yīng)現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和頻繁的貿(mào)易往來(lái)。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，與普通PCR不同，其模仿體內(nèi)復(fù)制機(jī)理，反應(yīng)不需要退火過(guò)程，整個(gè)反應(yīng)簡(jiǎn)單快速，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)。利用該方法建立的檢測(cè)技術(shù)體系，適合于大規(guī)模的轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)，可以極大的提高現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)效率，并為我國(guó)在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)方面躋身世界前列奠定良好的基礎(chǔ)。

RPA方法的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計(jì)。PCR引物多半是不適用的，這是因?yàn)椋琑PA引物比一般PCR引物長(zhǎng)，通常需要達(dá)到30-38個(gè)堿基，引物過(guò)短會(huì)降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度。因此，RPA的引物設(shè)計(jì)難度較大。探針?lè)ǖ娜秉c(diǎn)則是探針設(shè)計(jì)上有難度。另外，探針?lè)ㄔ跀U(kuò)增反應(yīng)完畢后需要用熒光讀取儀器才可以完成最后的結(jié)果顯示。

并且，當(dāng)前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)顯示結(jié)果采用電泳法時(shí)，需要用到高致癌性的熒光染料溴化乙錠，不僅危害操作人的健康，而且無(wú)法排除假陽(yáng)性的問(wèn)題，也不能進(jìn)行田間的現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)，這嚴(yán)重限制了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)效率，對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全管理是最大的制約。

目前，國(guó)際上已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中，如水稻、玉米、油菜、大豆等種子產(chǎn)品及以此為基礎(chǔ)的深加工食品、制品，很多品系均是采用NOS作為終止子，即T-NOS，常規(guī)的檢測(cè)手段需要將被檢樣品送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)T-NOS終止子的RPA引物、試劑盒及檢測(cè)方法，無(wú)需探針，利用生物素、地高辛和FITC分別標(biāo)記RPA正反向引物的5’端，能快速檢測(cè)被檢制品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，具有高度專(zhuān)一性，靈敏度高，檢測(cè)速度快，直觀(guān)性強(qiáng)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一組NOS終止子的RPA引物，包括：

RPA-nos-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；

RPA-nos-R：5'-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。

檢測(cè)T-NOS終止子的RPA標(biāo)記引物組，其由正向引物RPA-nos-F-地和反向引物RPA-nos-R-FITC組成，或由正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-FITC組成，或由正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-地組成；其中，所述正向引物為經(jīng)生物素或地高辛對(duì)RPA引物RPA-nos-F的5'端標(biāo)記的標(biāo)記引物，具體為：

RPA-nos-F-地：

5'-Dig-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；

RPA-nos-F-生：

5'-Biotin-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；

所述反向引物為用FITC或地高辛對(duì)RPA引物RPA-nos-R的5'端標(biāo)記的標(biāo)記引物，具體為：

RPA-nos-R-FITC：

5'-6-FAM-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'；

RPA-nos-R-地：

5'-Dig-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。

一種檢測(cè)T-NOS終止子的RPA檢測(cè)試劑盒，其含有所述的RPA引物或所述的RPA標(biāo)記引物組。

一種檢測(cè)T-NOS終止子的RPA檢測(cè)方法，包括以下步驟：

1)提取待測(cè)樣品的DNA；

2)RPA擴(kuò)增

以待測(cè)樣品的DNA作為模板，將所述的RPA標(biāo)記引物組加入到RPA擴(kuò)增反應(yīng)體系中，進(jìn)行RPA擴(kuò)增，得到雙標(biāo)記的核酸恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物；

3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)