[發(fā)明專利]一種檢測T?NOS終止子的RPA引物、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710202817.0
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN106868181A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設計）人: 劉華;唐雪明;白藍;鄭思英;王金斌;蔣瑋;吳瀟;潘愛虎;賈軍偉
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海開祺知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司31114
• 代理人: 費開逵

1.一組檢測T-NOS終止子的RPA引物，包括：

RPA-nos-F：5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；

RPA-nos-R：5'-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。

2.檢測T-NOS終止子的RPA標記引物組，其由正向引物RPA-nos-F-地和反向引物RPA-nos-R-FITC組成，或由正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-FITC組成，或由正向引物RPA-nos-F-生和反向引物RPA-nos-R-地組成；

其中，所述正向引物為經(jīng)生物素或地高辛對權(quán)利要求1所述RPA-nos-F引物的5'端標記的標記引物，具體為：

RPA-nos-F-地：

5'-Dig-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；

RPA-nos-F-生：

5'-Biotin-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC-3'；

所述反向引物為用FITC或地高辛對權(quán)利要求1所述RPA-nos-R引物的5'端標記的標記引物，具體為：

RPA-nos-R-FITC：

5'-6-FAM-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'；

RPA-nos-R-地：

5'-Dig-TCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGAC-3'。

3.一種檢測T-NOS終止子的RPA檢測試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的RPA引物或權(quán)利要求2所述的RPA標記引物組。

4.一種檢測T-NOS終止子的RPA檢測方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣品的DNA；

2)RPA擴增

以待測樣品的DNA作為模板，將權(quán)利要求2所述的RPA標記引物組加入到RPA擴增反應體系中，進行RPA擴增，得到雙標記的核酸恒溫擴增產(chǎn)物；

3)擴增產(chǎn)物檢測

將吸附著生物素抗體及異硫氰酸熒光素抗體的核酸檢測試紙條插入步驟2)的擴增產(chǎn)物中，側(cè)向?qū)游?～15分鐘；

根據(jù)顯色條帶進行判定：試紙條在檢測線和對照線處都有紫色條帶，則表示待測樣品中含有T-NOS終止子；若僅在對照線處有紫色條帶，則表示待測樣品中不含有T-NOS終止子，若檢測線和對照線處均無紫色條帶，則表示無擴增或試紙條無效。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測T-NOS終止子的RPA檢測方法，其特征在于，所述的RPA反應體系中，DNA模板的終濃度為0.5～2ng/μl，正向引物和反向引物的終濃度各為0.3～0.6μmol/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測T-NOS終止子的RPA檢測方法，其特征在于，所述RPA反應體系總體積為50μl，其中，濃度為10μmol/L的正、反向標記引物各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的DNA模板加入2μl，RPA反應緩沖液29.5μl，ddH₂O補足至50μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述檢測T-NOS終止子的RPA檢測方法，其特征在于，步驟2)中，RPA擴增反應程序為：恒溫36-38℃，16～20分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的檢測T-NOS終止子的RPA檢測方法，其特征在于，步驟2)中，RPA擴增反應程序為：于36-38℃恒溫反應4分鐘，取出，混合均勻，再擴增16分鐘。