[發(fā)明專利]一種組織工程皮膚修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710201874.7
• 申請(qǐng)日: 2017-03-30
• 公開（公告）號(hào): CN106962274A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江蕾微;陸洪光;聶瑛潔;陳旭娥;王文雯;李遠(yuǎn)英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 貴州省人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): A01K67/02
• 分類號(hào): A01K67/02
• 代理公司: 常州市華信天成專利代理事務(wù)所(普通合伙)32294
• 代理人: 何學(xué)成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種組織工程皮膚修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究方法。

背景技術(shù)

組織工程皮膚的最終目的是將形成人工皮膚產(chǎn)品,移植于需要修復(fù)、重建的皮膚缺損處，達(dá)到修復(fù)人體缺損皮膚組織的目的。近年來國內(nèi)外專家不斷嘗試將各種類型的組織工程皮膚產(chǎn)品應(yīng)用在臨床上。因干細(xì)胞夠使得組織工程皮膚不斷的自我更新和增殖，能取得了不錯(cuò)的修復(fù)效果，故現(xiàn)很多學(xué)者已應(yīng)用干細(xì)胞作為組織工程皮膚種子細(xì)胞來構(gòu)建組織工程皮膚。但這些干細(xì)胞的應(yīng)用都存在著一定的限制，如它的來源、數(shù)量、取材創(chuàng)傷等都制約著其發(fā)展。我們借助組織工程技術(shù)已成功構(gòu)建hAECs-DED組織工程皮膚。hAECs在DED上形成角化較好的復(fù)層上皮組織，不僅組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)與正常人皮膚相似，且新生上皮增殖及分化的特征也與正常人皮膚相似。

皮膚移植物最早是作為皮膚覆蓋物補(bǔ)充皮膚和暫時(shí)封閉傷口，并促進(jìn)愈合。組織工程皮膚移植是將體外培養(yǎng)的功能細(xì)胞與適當(dāng)?shù)募?xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合，將其移植到病損部位，在細(xì)胞外基質(zhì)逐步降解的過程中，種植的細(xì)胞通過增殖分化形成了具有其固有功能的活性組織。它是目前治療難治性潰瘍、大面積燒傷等皮膚缺損性疾病最有效的方法之一。但目前很多組織工程皮膚產(chǎn)品仍不成熟，存在著皮膚耐磨性差、自體種子細(xì)胞來源缺乏、異體種子細(xì)胞誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)、培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)、治療費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)。構(gòu)建的組織工程皮膚根據(jù)所含結(jié)構(gòu)層次不同可分為三種類型:組織工程表皮、組織工程真皮和組織工程全層皮膚。組織工程表皮存在不耐磨、易收縮、易起泡等缺點(diǎn)，而且創(chuàng)面愈合后仍會(huì)出現(xiàn)瘢痕增生，抗感染能力差，彈性欠佳，柔軟度不足等問題，故這種方法在臨床應(yīng)用中受到了很大限制。組織工程真皮在皮膚重建過程可增加創(chuàng)面愈合后的皮膚彈性、柔軟性及機(jī)械耐磨性，減少瘢痕增生，且組織工程真皮中存在的活性成纖維細(xì)胞可促進(jìn)表皮生長(zhǎng)分化，誘導(dǎo)基底膜形成。但其移植后只能夠起到真皮重建的作用。理想的組織工程皮膚應(yīng)同時(shí)修復(fù)表皮和真皮組織，因?yàn)檫@兩種組織結(jié)構(gòu)不僅影響皮膚的功能和外形，且具有相互影響的機(jī)制，能夠促進(jìn)彼此的分化。因此，今后皮膚組織工程研究的方向主要是探索構(gòu)建組織工程全層皮膚的新方法。目前，國內(nèi)外的學(xué)者做過較多的組織工程全層皮膚移植的實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用的研究，如Pellegrini等通過篩選全克隆干細(xì)胞集落作為構(gòu)建人工皮膚的表皮種子細(xì)胞，用Fibrin做支架接種成纖維細(xì)胞構(gòu)建真皮層，所制成的人工復(fù)合皮用于大面積燒傷患者的治療。

現(xiàn)組織工程皮膚移植的研究進(jìn)展緩慢，其中一個(gè)主要原因就是移植于人體的臨床研究受到倫理學(xué)等多方面的制約。裸鼠由于無胸腺，致T細(xì)胞生成障礙，因此缺乏免疫反應(yīng)，是免疫缺陷動(dòng)物，故容易植入異種細(xì)胞和組織，已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)采用裸鼠為載體研究移植免疫取得了良好的效果。裸鼠體內(nèi)缺乏有效的免疫反應(yīng)，不易排斥植入的人皮膚組織，可將人皮膚移植于裸鼠后構(gòu)建人皮膚-裸鼠模型。Berthod等將成纖維細(xì)胞、表皮干細(xì)胞種植在膠原海綿支架上，體外培養(yǎng)后移植至裸鼠背部。來自宿主的血管逐漸深入膠原海綿支架達(dá)到表皮下，并可形成完整的血管網(wǎng)，該重建皮膚成熟后能夠促進(jìn)多種細(xì)胞外基質(zhì)的合成，并能產(chǎn)生彈性蛋白，可促進(jìn)皮膚功能恢復(fù)和阻止植皮后疤痕的形成。裸鼠血管能逐漸侵入人皮膚的真皮，與其真皮微血管相互吻合，提供適宜的體內(nèi)微環(huán)境維持人皮膚的正常結(jié)構(gòu)。故以裸鼠為皮膚缺損的動(dòng)物模型，可用于觀察組織工程皮膚移植成活后的結(jié)構(gòu)合理性，以及種子細(xì)胞在體內(nèi)增殖分化的情況。

為驗(yàn)證體外構(gòu)建的組織工程皮膚是否具有正常功能且在移植后能否發(fā)揮其表皮重建的作用，本發(fā)明把構(gòu)建的hAECs-DED組織工程皮膚移植于裸鼠創(chuàng)面，從創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面愈合時(shí)間、組織病理學(xué)等方面檢測(cè)和了解組織工程皮膚產(chǎn)品的效果，為將來的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：提供一種組織工程皮膚修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種組織工程皮膚修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究方法，包括以下步驟：

1)取3-4周齡健康雄性裸鼠，20只，根據(jù)抽簽法隨機(jī)分為2組，分別為組織工程組和空白對(duì)照組，每組10只裸鼠；均以5％水合氯醛0.01ml/g進(jìn)行腹腔注射，3-5分鐘后裸鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)；

2)待裸鼠麻醉后將其固定,常規(guī)用酒精及聚維酮碘消毒裸鼠背部皮膚，鋪洞巾；以裸鼠背部正中為中心點(diǎn)，用眼科剪剪成直徑約為1cm的圓形缺損，使該處全層皮膚去除，后用青鏈霉素混合液清洗傷口，以預(yù)防感染；