[發明專利]一種組織工程皮膚修復裸鼠全層皮膚缺損的實驗研究方法

在審

• 申請號: 201710201874.7
• 申請日: 2017-03-30
• 公開（公告）號: CN106962274A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 江蕾微;陸洪光;聶瑛潔;陳旭娥;王文雯;李遠英
• 申請（專利權）人: 貴州省人民醫院
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02
• 代理公司: 常州市華信天成專利代理事務所(普通合伙)32294
• 代理人: 何學成

1.一種組織工程皮膚修復裸鼠全層皮膚缺損的實驗研究方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取3-4周齡健康雄性裸鼠，20只，根據抽簽法隨機分為2組，分別為組織工程組和空白對照組，每組10只裸鼠；均以5％水合氯醛0.01ml/g進行腹腔注射，3-5分鐘后裸鼠進入麻醉狀態；

2)待裸鼠麻醉后將其固定,常規用酒精及聚維酮碘消毒裸鼠背部皮膚，鋪洞巾；以裸鼠背部正中為中心點，用眼科剪剪成直徑約為1cm的圓形缺損，使該處全層皮膚去除，后用青鏈霉素混合液清洗傷口，以預防感染；

3)組織工程組裸鼠缺損處用構建的hAECs-DED組織工程皮膚覆蓋創面，所述的hAECs-DED組織工程皮膚是以人羊膜上皮細胞(hAECs)作為種子細胞，以人去表皮的真皮組織(De-epidermized dermis,DED)作為支架材料，將種子細胞種植于支架材料上構建而成的hAECs-DED組織工程皮膚；空白對照組不用任何東西覆蓋，后均用凡士林油紗布覆蓋創面，打包縫合創面并稍加壓包扎；每只分籠飼養；術后1周拆除紗布包并揭去油紗，常規換藥，連續觀察4周；

4)術后創面愈合情況觀察及組織學檢測：術后連續觀察創面的愈合情況，分別于一周，兩周，三周，四周對比創面愈合情況，根據肉眼觀察記錄兩組創面愈合時間；用透明薄膜法計算兩組的創面愈合率，即創面愈合率＝(原始創面面積-未愈合創面面積)/原始創面面積；

5)于術后四周在裸鼠背部術區取材，用10％福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，組織切片，進行HE染色；

6)統計學分析：采用SPSS19.0統計軟件,計量資料采用成組t檢驗，計數資料采用卡方檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2.如權利要求1所述的一種組織工程皮膚修復裸鼠全層皮膚缺損的實驗研究方法，其特征在于，所述hAECs-DED組織工程皮膚的構建方法為：采用低濃度胰蛋白酶多步消化分離法來提取hAEC,并用兩步酶消化法處理健康小兒包皮，獲得成纖維細胞懸液，傳代培養；將體外擴增培養至第3-5代的成纖維細胞和第2代的hAEC分別接種在DED真皮面和基底膜面，體外器官培養構建組織工程皮膚。

3.如權利要求2所述的一種組織工程皮膚修復裸鼠全層皮膚缺損的實驗研究方法，其特征在于，所述hAECs-DED組織工程皮膚的具體構建方法為：

1)hAECs的分離培養及hAECs細胞懸液的制備：

將羊膜組織用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復加以沖洗后剪成細碎小塊，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，37℃消化10min，棄消化液；后重復上述方法消化上皮細胞，37℃消化30-40min，200目不銹鋼網過濾；收集單細胞懸液，加含10％胎牛血清的培養基終止消化；過濾后組織碎片用同樣方法重復消化1次；離心收集的細胞用添加10ng/ml EGF的DMEM完全培養基培養，置于37℃、5％CO₂孵育箱內培養；24h首次換液，后每3天全量換液一次，約10天后細胞可按常規方法傳代培養；第二代hAEC細胞爬片后用4％多聚甲醛固定，分別進行Oct-3/4、SSEA-4免疫熒光檢測；倒置顯微鏡觀察hAECs生長狀態，取第1-2代對數生長期hAECs；吸去培養基，以PBS液清洗兩遍；加入0.25％胰蛋白酶，輕搖培養瓶，消化貼壁細胞；鏡下觀察細胞由卵圓形變圓、細胞間隙增大，少量細胞開始脫落時，加入含10％FBS的DMEM培養基終止消化；吹打培養瓶壁上細胞，離心收集細胞；棄上清液，重懸于hAECs完全培養基中制成細胞懸液，計數，調整細胞濃度至5x10⁶/ml，待用；

2)成纖維細胞(FB)的分離培養及Fb細胞懸液的制備：

將表皮組織標本浸入D-Hanks溶液中，4℃保存備用，6個小時內使用；將包皮在無菌條件下用PBS沖洗5遍，用眼科剪剪去皮下組織,將皮膚組織剪成大小約0.5cm×1cm的細長條，放入2.5mg/ml Dispase酶中4℃消化16～18h；次日取出，將表皮與真皮分離；將分離出的真皮組織放入10ml的無菌青霉素瓶中，加入0.2％Ⅳ型膠原酶溶液3ml，37℃消化2～3h，消化后用眼科剪刀將真皮組織剪碎，向瓶中加入含10％FBS的DMEM 3ml終止消化，巴氏吸管吹打數十次，低速離心，棄上清液，用含10％FBS的DMEM培養基1ml重懸，計數板計算，調整細胞密度為2×10⁶/ml，接種于一次性培養瓶中；置5％CO₂、37℃孵箱中培養，24h后首次換液去除未貼壁的細胞，以后2～3天換液1次；7～10天后培養細胞達到70％～80％融合狀態時，傳代純化培養，可獲得成纖維細胞(FB)；倒置顯微鏡觀察Fb生長狀態，取第3代對數生長期Fb；吸去培養基，以PBS液清洗兩遍；加入0.25％胰蛋白酶，輕搖培養瓶，消化貼壁細胞，加入含10％FBS的DMEM培養基終止消化；吹打培養瓶壁上細胞，離心收集細胞；棄上清液，重懸于含10％FBS的DMEM培養基中制成細胞懸液，計數，調整細胞濃度至5x105/ml，待用；

3)DED的制備及預處理：

取成人皮膚標本常規消毒，加入適量PBS，置于4℃冰箱中備用；制備前用PBS清洗標本數次，常規消毒；用眼科剪小心去除皮下脂肪組織層，制成lcm×1cm大小皮片；浸于56℃PBS中30min；用眼科鑷去除表皮，將人去表皮的真皮組織(De-epidermized dermis,DED)置于Epp管中，迅速置入液氮中約5min，取出后室溫放置30min，然后再置入液氮中，連續10個循環；后置于-20℃冰箱中保存備用；將DED置于4℃冰箱中12h，然后浸于hAECs完全培養基中；5％CO₂、37℃環境中浸泡48h，備用；

4)hAECs-DED組織工程皮膚的構建：

將經預處理的DED，置于六孔板中，DED基底膜面向下，加入hAEC完全培養基，1ml/孔，用移液器將備好的FB細胞懸液150μl接種于1-5孔的DED上，第6孔中DED上加150μlPBS作為空白對照；置于5％CO₂、37℃環境中孵育過夜，以促使FB能夠貼附于DED的網狀真皮面；孵育過夜后，把DED翻轉，使DED的基底膜面朝上，將備好的hAEC細胞懸液150μl接種于1-5孔的DED基底膜面上，第6孔中加入150μlPBS作為空白對照，后每孔加入hAEC完全培養基，使之浸沒DED，置于5％CO₂、37℃環境中培養；液下培養3天，使得hAEC達到融合，后將DED置于支撐架上，調整培養基的量，使hAEC在氣液界面上培養生長；5％CO₂、37℃環境中繼續氣-液面培養2周。