[發明專利]一種去甲基化試劑在人白血病細胞中的應用

在審

• 申請號: 201710198677.4
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106929476A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 王黎;程嬌;崔昌浩;郭兆明;馬昆;張瀚文;于冬麗;林凡琳;鄧營營;刁冠頔
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 大連理工大學專利中心21200
• 代理人: 溫福雪,侯明遠

技術領域

本發明涉及細胞分裂素ortho-Topolin Riboside(oTR)作為一種去甲基化試劑對人白血病細胞株的抗腫瘤作用，屬于生物化學與分子生物學技術領域。

背景技術

白血病是造血組織的惡性疾病，又稱“血癌”。造血細胞的某一系列、主要是某一白細胞系列的前體細胞失去分化成熟能力，在骨髓中和其他造血組織中呈惡性克隆性增生、積聚，并侵犯肝、脾、淋巴結，最終浸潤破壞全身組織、器官，使正常造血功能受到抑制。白血病與實體腫瘤不同，不是生長在局部的贅生物，而是全身散播，可能侵犯各系統、器官和組織的惡性血液病。臨床表現為貧血、出血、感染及各器官浸潤癥狀。根據國外統計，白血病約占腫瘤總發病率的3％左右，是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤。白血病的發病率在世界各國中，歐洲和北美發病率最高，其死亡率為3.2-7.4/10萬人口。亞洲和南美洲發病率較低，死亡率為2.8-4.5/10萬人口。傳統的治療以聯合化療為主，而患者的完全緩解率和長期無病生存率均較低，然而常用的化療藥物如阿糖胞苷(Ara-C)具有骨髓抑制，神經毒性等副作用。因此，尋找有效提高治療效率，毒副作用小的天然藥物來治療白血病是十分必要的。

白血病的發生發展是多因素參與、多步驟的復雜過程,涉及遺傳學和表觀遺傳學改變。近年來的研究發現,DNA甲基化是人類白血病中普遍存在的現象,與其發病密切相關。啟動子區CpG島高甲基化(hypermethylation)是抑瘤基因、DNA修復基因、促凋亡基因失活的主要方式之一。甲基轉移酶抑制劑如5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycitydine,5-aza-2dC)能使甲基化沉默的基因重新表達,恢復其正常功能,在白血病治療中具有良好的應用前景。國外已有應用甲基轉移酶抑制劑如阿扎胞苷、地西他濱、普魯卡因胺等治療急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia,AML)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyn drome,MDS)和慢性粒細胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)的臨床實驗報道。但是這些臨床試驗階段的去甲基化試劑具有胃腸反應、骨髓移植、肝損害、神經毒性和肺功能衰竭等的較大的毒副作用，限制了臨床應用。因此尋找更有效且毒副作用小的天然來源的去甲基化試劑顯得尤為重要。

N6-2-芐胺羥基-9-呋喃核糖基嘌呤(ortho-Topolin Riboside，oTR)是一種存在于黎明時楊樹葉子內合成的天然核苷類芳香族細胞分裂素。2010年根據美國國立癌癥研究中心(NIC)測試結果發現，oTR對人的9大瘤系60種腫瘤細胞系(NIC₆₀)具有非常顯著的體外增殖抑制活性，其中對白血病細胞株的藥物敏感性最強(IC₅₀≦1.7μM)。并且通過藥物體內篩選模型-中空纖維法發現oTR在體內對一些腫瘤模型小鼠無明顯的急性毒性反應。上述結果充分表明oTR作為一種核苷類細胞分裂素具有很強的抗腫瘤臨床應用潛力和臨床藥用研發價值。

人類DNA甲基化的修飾主要通過DNA甲基轉移酶1(DNMT1)和DNA甲基轉移酶3(DNMT3)完成。其中，DNMT1含量最多，也是調節CpG島DNA甲基化狀態最重要的酶。但是目前關于oTR是否通過對DNMT1來調節去甲基化作用并發揮抗腫瘤作用的研究尚未見報道。

發明內容

本發明針對上述現有技術，本發明提供了oTR在人白血病細胞株中抗腫瘤的應用。

本發明的技術方案：

一種去甲基化試劑在人白血病細胞中的應用，步驟如下：

(1)細胞培養：將人白血病細胞株THP-1懸浮于含有滅活胎牛血清的無菌RPMI 1640培養液中，置于濃度為5％CO₂、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養箱中培養，細胞長至培養瓶底面積的70％～80％傳代1次；

(2)藥物配制：Ara-C用無菌RPMI 1640培養基溶解，oTR用0.1％DMSO溶解，繼續用無菌RPMI 1640培養基將溶解好的Ara-C和oTR稀釋至濃度為0.1μM-30μM，過濾除菌，室溫保存；