[發(fā)明專利]一種去甲基化試劑在人白血病細胞中的應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710198677.4
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106929476A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設計）人: 王黎;程嬌;崔昌浩;郭兆明;馬昆;張瀚文;于冬麗;林凡琳;鄧營營;刁冠頔
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 大連理工大學專利中心21200
• 代理人: 溫福雪,侯明遠

1.一種去甲基化試劑在人白血病細胞中的應用，其特征在于，步驟如下：

(1)細胞培養(yǎng)：將人白血病細胞株THP‐1懸浮于含有滅活胎牛血清的無菌RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于濃度為5％CO₂、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長至培養(yǎng)瓶底面積的70％～80％傳代1次；

(2)藥物配制：Ara‐C用無菌RPMI 1640培養(yǎng)基溶解，oTR用0.1％DMSO溶解，繼續(xù)用無菌RPMI 1640培養(yǎng)基將溶解好的Ara‐C和oTR稀釋至濃度為0.1μM‐30μM，過濾除菌，室溫保存；

(3)處理細胞：將處于對數(shù)生長期的5×10³～1×10⁴個細胞接種于每孔含有100μlRPMI 1640培養(yǎng)液的96孔板中，設置10組實驗，每組4個復孔，第1組：空白對照組；第2組：0.1％DMSO組；第3組：0.3μΜoTR組；第4組：1.5μΜoTR組；第5組：15μΜoTR組；第6組：30μΜoTR組；第7組：0.3μΜAra-C組；第8組：1.5μΜAra-C組；第9組：15μΜAra-C組；第10組：0.3μΜAra-C組，分別向各組中加入對應的藥物，置于濃度為5％CO₂、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育3-5天，細胞計數(shù)；

(4)檢測細胞增殖抑制率：將處于對數(shù)生長期的5×10³～1×10⁴個細胞接種于每孔含有100μlRPMI 1640培養(yǎng)液的96孔板中，依據(jù)步驟(3)處理細胞的方法再一次處理細胞，置于濃度為5％CO₂、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育3‐5天，各4個復孔；采用CCK‐8試劑盒進行檢測，每孔細胞懸液中加10μl CCK‐8溶液，置于37℃，CO₂培養(yǎng)箱中孵育2h，測定450nm處各組細胞的吸光度，記錄數(shù)據(jù)；

(5)檢測細胞亞倍體峰：將生長狀態(tài)活躍的THP‐1細胞用oTR處理48h后，用流式管分裝成三個樣品，按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書配制染色緩沖液，每個樣品加入500μl染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用PBS洗一次；300目篩網(wǎng)過濾后用BD FACSCalibur流式細胞儀上機檢測，計算細胞凋亡率；

(6)檢測oTR對DNMT1酶活性的影響：提取步驟(3)各組處理后的細胞核蛋白，按照epiquickDNA甲基轉移酶活性/抑制分析試劑盒用酶標儀在450nm讀取吸光值并計算DNMT活性；DNMT1進行體外表達克隆和純化，在450nm下讀取吸光值檢測oTR對DNMT1的抑制活性；

(7)生物信息學分子對接實驗：采用生物信息學分子對接模擬方法，將甲基轉移酶的天然底物S‐腺苷高半胱氨酸與DNMT1模擬對接空間作用力以及oTR與DNMT1模擬對接空間作用力。