[發明專利]一種Smad4蛋白可結合DNA片段及在Smad4活性檢測中的應用

有效

• 申請號: 201710197699.9
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106868007B
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發明（設計）人: 鄭麗端;童強松;肖文晶;王建群;洪梅;葉霖;李聃;宋華杰
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6897;C12N15/85
• 代理公司: 42250 武漢泰山北斗專利代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 程千慧

本發明涉及一種Smad4蛋白可結合的DNA片段，其包含一個或多個Smad4蛋白結合框；還涉及該DNA片段的應用；還涉及一種用于檢測細胞內Smad4轉錄調控活性的方法。通過使用本發明的DNA片段和方法，可直接針對性地檢測細胞內Smad4的轉錄調控活性，而非僅僅檢測其轉錄本或蛋白質的含量，從而使得能夠更準確地分析Smad4作為轉錄因子在一些發育生物學和病理學發展中所起的作用。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，更特別地，涉及一種Smad4蛋白可結合的DNA片段及其在檢測細胞內Smad4轉錄調控活性中的應用。

背景技術

Smad4是從染色體18q21.1分離出的一個腫瘤抑制基因，其編碼的Smad4蛋白屬于SMAD信號轉導家族中的一員，是一類在真核生物中分布廣泛的多功能轉錄調節因子，參與了轉化生長因子TGF-β超家族細胞內信號傳導過程，在基因轉錄水平的調控中發揮至關重要的作用，并參與多種生物學功能的調控。

Smad4蛋白由進化上高度保守的N末端MH1、C末端MH2結構域以及中間富含脯氨酸的高變連接區組成，Smad4蛋白可與其他種類的SMAD蛋白結合形成SMAD復合物，協同調節靶基因的轉錄，控制腫瘤細胞生長、分化及凋亡；還可通過結合DNA來發揮其生物學功能。Smad4作為轉錄調節因子的作用十分關鍵，TGF-β/Smads信號轉導途徑的異常可引起疾病的發生或腫瘤的形成。Smad4的缺失和突變可以導致胰腺癌、幼年息肉樣綜合征、遺傳性出血性毛細血管綜合征等重大疾病；Smad4基因沉默、活性位點突變等有可能促進裸鼠移植瘤增殖和微血管形成。Smad4表達水平的變化會影響疾病的發生發展，因此有可能作為研究這些疾病的病理學發展過程的標志之一。

目前，對Smad4的檢測主要依靠Western Blot或者qRCR等技術。這類技術雖然靈敏度高，但檢測到的只是Smad4蛋白含量的差異，并不能直接體現其結合到靶序列后活性的改變。

因此，需要設計一種新的用于檢測細胞內Smad4轉錄調控活性的方法。

發明內容

發明人通過研究發現，Smad4蛋白結合的DNA序列存在高度的保守性，其結合的DNA核心序列為5’-CAGAC-3’。

基于以上研究，本發明提供了一種Smad4蛋白可結合的DNA片段，其包含多個Smad4蛋白結合框，所述Smad4蛋白結合框的序列包含5’-CAGAC-3’，并且還包含一段富GC序列。每兩個相鄰的Smad4蛋白結合框之間具有間隔序列，并且所述間隔序列為AT。用多個結合框可提高Smad4蛋白的識別和結合效率，提高靈敏度。得到的DNA片段序列如SEQ ID NO:1所示。在研究過程中，我們試驗了多種組合，結果發現該序列的DNA片段比其他組合方式對Smad4蛋白的結合效率更高。

本發明還提供了上述DNA片段在檢測細胞內Smad4轉錄調控活性中的應用。

本發明還提供了一種用于檢測細胞內Smad4轉錄調控活性的方法，其包括以下步驟：

S1：將包括上述DNA片段以及連接于所述DNA片段下游的報告基因表達框的報告基因系統導入所述細胞；

S2：通過檢測所述報告基因的表達來計算所述細胞內Smad4轉錄調控活性。可將報告基因的表達強度作為衡量Smad4轉錄調控活性的指標。

優選地，所述報告基因系統為雙熒光素酶報告基因系統，包括重組質粒和對照質粒，并且所述重組質粒帶有所述DNA片段以及連接在所述DNA片段下游的熒光素酶I的表達框，所述對照質粒帶有熒光素酶II的表達框，所述熒光素酶I與所述熒光素酶II激發產生的熒光波長不同。將Smad4轉錄調控活性表示為熒光素酶I激發產生的熒光強度與熒光素酶II激發產生的熒光強度的比值。

優選地，所述重組質粒通過將所述DNA片段插入至質粒pGL3-Basic的Kpn I與HindIII位點之間得到。