[發明專利]一種制備動脈粥樣硬化疾病模型犬的方法

有效

• 申請號: 201710197156.7
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106987604B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 趙建平;鄭敏;馮沖;李京;李茗瑜;陳奔馳
• 申請（專利權）人: 北京希諾谷生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 張穎;王朋飛

本發明涉及一種制備動脈粥樣硬化疾病模型犬的方法，尤其是涉及利用基因敲除技術制備載脂蛋白E(APOE)基因敲除疾病模型犬的方法。

技術領域

本發明涉及利用基因敲除技術制備動脈粥樣硬化疾病模型犬的方法，尤其是涉及利用基因敲除技術制備載脂蛋白E基因敲除疾病模型犬的方法。

背景技術

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是由遺傳、環境等多因素導致的老年多發性疾病，是冠心病、腦梗死、外周血管病等心腦血管疾病的主要原因。冠狀動脈粥樣硬化者若管徑狹窄達75％以上，可發生心絞痛、心肌梗死、心律失常，甚至猝死；腦動脈粥樣硬化可引起腦缺血、腦萎縮，或造成腦血管破裂出血。

AS病因復雜，其發病與多種致病因素有關，多發生在大中型彈性血管，肌性動脈壁內膜及內膜下，以脂質沉積、內膜增厚為特征，形成粥樣病灶或纖維脂質斑塊。在眾多的致病因素中，脂質代謝紊亂，尤其是高膽固醇血癥與其關系最為密切。載脂蛋白(apolipoprotein，Apo)E是血漿脂蛋白的重要成分，在調節血漿膽固醇水平、脂質的運輸和代謝中起重要的作用，是高脂血癥、AS等發生、發展的一個重要的分子靶標，尤其在AS的發生發展中起著關鍵性的作用。

近年來AS有逐漸年輕化和上升趨勢。因此，需要建立動脈粥樣硬化動物模型，從而對其病因和治療藥物進行深入研究。雖然小鼠和大鼠是最常用的動物模型，但是鼠具有AS抗性，而且形成的病理改變雖然與人早期病變相似，不易形成類似人體的后期病變，而且小鼠取血不便。

犬是目前基礎醫學研究和教學中最常用的實驗動物之一，尤其在生理、藥理和病理生理學等實驗研究中起著重要作用。犬在遺傳性疾病方面與人類也比較相似。且犬的遺傳性疾病少，實驗重復性好，血液循環和神經系統發達，消化系統及內臟與人相似，在毒理方面的反應與人類比較接近，尤其適合藥理、循環生理、眼科、毒理、外科學等的研究，另外犬性格溫順容易調教，經短期訓練能很好地配合實驗，被國際醫學、生物學界公認為較理想的實驗用犬。

目前常用的制備犬疾病模型的方法主要包括：飼喂法、機械損傷法及免疫學方法等。由于飼喂法、機械損傷法和免疫學法均為在健康動物基礎上，采用特殊的方法誘導其出現疾病表型。但是，這些誘導型的犬動物模型存在無法出現疾病表型、表型持續時間較短或無法模擬人類疾病癥狀等問題。

利用基因工程方法對非人動物進行基因敲除或轉基因修飾建立疾病動物模型可以克服上述誘導型動物模型的缺點，但是這些基因敲除或者轉基因修飾技術應用最成熟的實驗動物是鼠，對于大型哺乳動物的基因敲除或者轉基因修飾模型還處于探索階段。即使牛、羊、豬、猴等大型哺乳動物陸續有報道基因敲除動物模型的建立，由于犬繁殖生理與其他哺乳動物有很大區別，造成對犬卵母細胞及胚胎進行體外操作難度極大，基因敲除或者轉基因修飾模型犬的建立難度大為增加。因此，即便對于基因敲除或者轉基因修飾疾病模型犬有著大量的需求，世界上鮮有成功建立基因敲除或者轉基因修飾疾病模型犬的報道。動脈粥樣硬化病基因敲除或者轉基因修飾模型犬更沒有相關報道。

因此，非常需要建立動脈粥樣硬化病基因敲除或者轉基因修飾模型犬，這樣的基因敲除或者轉基因修飾模型犬的疾病癥狀為原發癥狀，疾病表型持續時間長，且具有可遺傳性，通過自然繁殖即可獲得子代疾病模型犬。從而，為心血管疾病的研究和相關的藥物研發提供合適的基因敲除或者轉基因修飾實驗動物模型。

發明內容

本發明利用基因敲除修飾技術獲得APOE基因敲除修飾犬受精卵，然后將犬受精卵移植到雙側輸卵管均進行了沖胚的母犬的一側輸卵管內，制備了APOE基因敲除犬。

第一方面，本發明提供了用于建立APOE基因敲除犬模型的方法，所述方法包括如下步驟：(1)利用基因編輯技術獲得APOE基因敲除修飾犬受精卵；以及(2)將犬受精卵移植到雙側輸卵管均進行了沖胚的母犬的一側輸卵管內制備了APOE基因敲除犬。

所述步驟(1)中的基因編輯技術包括：CRISPR，TALEN和ZFN。