[發明專利]一種制備動脈粥樣硬化疾病模型犬的方法

有效

• 申請號: 201710197156.7
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106987604B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 趙建平;鄭敏;馮沖;李京;李茗瑜;陳奔馳
• 申請（專利權）人: 北京希諾谷生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 張穎;王朋飛

1.用于建立表現出動脈粥樣硬化表型的APOE基因敲除犬模型的方法，所述方法包括如下步驟：(1)根據犬APOE基因序列，針對外顯子的序列確定打靶位點序列；(2)根據步驟(1)確定的打靶位點序列合成sgRNA序列及其互補序列，然后將合成的序列與骨架載體連接構建sgRNA打靶載體；(3)將sgRNA打靶載體體外轉錄獲得sgRNA的mRNA，以及將CRISPR/Cas9體外轉錄為mRNA；(4)將步驟(3)獲得的sgRNA的mRNA和CRISPR/Cas9的mRNA混合后胞質內注射到犬受精卵中；以及(5)將犬受精卵移植到雙側輸卵管均進行了沖胚的母犬的一側輸卵管內；

步驟(1)所述外顯子為外顯子3，所述外顯子3的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述步驟(1)中所述的打靶位點序列為針對外顯子3確定的如下序列：5'-CCGGGTGGCAGACTGGCCAGCCC-3'(SEQ ID NO：4)，所述外顯子3的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述步驟(2)中合成的sgRNA序列及其互補序列為：

sgRNA序列：ataGGGCTGGCCAGTCTGCCACCgt(SEQ ID NO：5)；以及

sgRNA互補序列：taaaacGGTGGCAGACTGGCCAGCC(SEQ ID NO：6)；

所述步驟(5)中將犬受精卵移植到雙側輸卵管均進行了沖胚的母犬出血較少的一側輸卵管內。

2.犬APOE的基因敲除打靶載體，其特征在于所述犬APOE的基因敲除打靶載體由針對犬APOE基因的外顯子中的打靶位點序列設計的sgRNA序列及其互補序列以及骨架載體構成；

所述外顯子為犬APOE基因的外顯子3，所述外顯子3的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述打靶位點序列為：

5'-CCGGGTGGCAGACTGGCCAGCCC-3'(SEQ ID NO：4)；

所述sgRNA序列及其互補序列為：

sgRNA序列：ataGGGCTGGCCAGTCTGCCACCgt(SEQ ID NO：5)；和

sgRNA互補序列：taaaacGGTGGCAGACTGGCCAGCC(SEQ ID NO：6)。

3.由權利要求1所述的方法獲得的APOE基因敲除犬的體細胞、組織和器官；

所述體細胞包含cctggaccagggaggct(SEQ ID NO：7)所示的序列。

4.APOE基因敲除比格犬耳成纖維細胞BGD-APOEKO-EF0，其保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No.13804，保藏日期為2017年3月1日。

5.用于檢測包含cctggaccagggaggct(SEQ ID NO：7)所示的序列片段的基因組序列的APOE基因敲除犬的引物對，其特征在于所述引物對針對cctggaccagggaggct(SEQ ID NO：7)所示的序列進行設計；

所述引物對的序列如下：

正向引物F:5'-CATTGTTGTCAGGCAGGTAGC-3'(SEQ ID NO：8)；和

反向引物R:5'-GAAGGGTGCGAGGGATTGA-3'(SEQ ID NO：9)。

6.用于檢測包含cctggaccagggaggct(SEQ ID NO：7)所示的序列片段的基因組序列的APOE基因敲除犬的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含針對cctggaccagggaggct(SEQ IDNO：7)所示序列設計的引物對；

所述引物對的序列如下：

正向引物F:5'-CATTGTTGTCAGGCAGGTAGC-3'(SEQ ID NO：8)；和

反向引物R:5'-GAAGGGTGCGAGGGATTGA-3'(SEQ ID NO：9)。