[發明專利]一種E2F1蛋白可結合DNA片段及在E2F1活性檢測中的應用

有效

• 申請號: 201710197057.9
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106868006B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發明（設計）人: 鄭麗端;童強松;洪梅;肖文晶;王建群;葉霖;李聃;宋華杰
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6897;C12N15/85
• 代理公司: 42250 武漢泰山北斗專利代理事務所(特殊普通合伙)
• 代理人: 程千慧

本發明涉及一種E2F1蛋白可結合的DNA片段，其包含一個或多個E2F1蛋白結合框；還涉及該DNA片段的應用；還涉及一種用于檢測細胞內E2F1轉錄調控活性的方法。通過使用本發明的DNA片段和方法，可直接針對性地檢測細胞內E2F1的轉錄調控活性，而非僅僅檢測其轉錄本或蛋白質的含量，從而使得能夠更準確地分析E2F1作為轉錄因子在一些發育生物學和病理學發展中所起的作用。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，更特別地，涉及一種E2F1蛋白可結合的DNA片段及其在檢測細胞內E2F1轉錄調控活性中的應用。

背景技術

轉錄因子E2F1是由人類E2F1基因編碼，是細胞周期相關轉錄因子E2F家族成員之一，其活化可將信號傳至核內，推動細胞周期由G1期進入到S期。E2F家族在控制細胞周期及抑癌基因功能上起到重要作用，也是小DNA致癌病毒轉化蛋白的靶點。E2F家族中多個成員蛋白包含許多進化保守的結構域，即DNA結合域、與蛋白相互作用的二聚化結構域、富含酸性氨基酸的轉活化結構域及位于轉活化結構域中的抑癌蛋白關聯結構域。

近年來研究發現，E2F1以細胞周期依賴性模式，優先與視網膜母細胞瘤蛋白pRB結合，介導細胞增殖及p53依賴性或非依賴性細胞凋亡。E2F1還參與腫瘤細胞代謝重編程，在腫瘤的發生、發展中起到重要作用。

在以上發育學或病理學過程中，E2F1作為轉錄調節因子的作用十分關鍵，其不同的剪切變體以及結合位點的改變均有可能造成其活性的改變，進而造成細胞功能紊亂，導致疾病的發生，甚至誘發惡性腫瘤。然而，目前檢測E2F1內源性活性仍然依靠WesternBlot或者RCR等技術，這類方法雖然靈敏度高，但檢測到的只是E2F1蛋白含量的差異，并不能直接體現其結合到靶序列后活性的改變。

因此，需要設計一種新的用于檢測細胞內E2F1轉錄調控活性的方法。

發明內容

發明人通過研究發現，E2F1蛋白結合的DNA序列存在高度的保守性，其結合的DNA核心序列為5’-TTTSSCGS-3’(S表示C或G)。

基于以上研究，本發明提供了一種E2F1蛋白可結合的DNA片段，其包含一個或多個E2F1蛋白結合框，所述E2F1蛋白結合框的序列為5’-TTTSSCGS-3’(S表示C或G)。

優選地，當包含多個E2F1蛋白結合框時，每兩個相鄰的E2F1蛋白結合框之間具有間隔序列，并且每兩個相鄰的E2F1蛋白結合框之間的間隔序列為所述間隔序列為2-4個A和/或T。用多個結合框可提高E2F1蛋白的識別和結合效率，提高靈敏度。

優選地，所述DNA片段的序列如SEQIDNO:1所示。在研究過程中，我們試驗了多種組合，結果發現該序列的DNA片段比其他組合方式對E2F1蛋白的結合效率更高。

本發明還提供了上述DNA片段在檢測細胞內E2F1轉錄調控活性中的應用。

本發明還提供了一種用于檢測細胞內E2F1轉錄調控活性的方法，其包括以下步驟：

S1：將包括上述DNA片段以及連接于所述DNA片段下游的報告基因表達框的報告基因系統導入所述細胞；

S2：通過檢測所述報告基因的表達來計算所述細胞內E2F1轉錄調控活性。可將報告基因的表達強度作為指示E2F1轉錄調控活性的指標。

優選地，所述報告基因系統為雙熒光素酶報告基因系統，包括重組質粒和對照質粒，并且所述重組質粒帶有所述DNA片段以及連接在所述DNA片段下游的熒光素酶I的表達框，所述對照質粒帶有熒光素酶II的表達框，所述熒光素酶I與所述熒光素酶II激發產生的熒光波長不同。將E2F1轉錄調控活性表示為熒光素酶I激發產生的熒光強度與熒光素酶II激發產生的熒光強度的比值。

優選地，所述重組質粒通過將所述DNA片段插入至質粒pGL3-Basic的KpnI與HindIII位點之間得到。