[發(fā)明專利]一種E2F1蛋白可結(jié)合DNA片段及在E2F1活性檢測中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710197057.9
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN106868006B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭麗端;童強(qiáng)松;洪梅;肖文晶;王建群;葉霖;李聃;宋華杰
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/6897;C12N15/85
• 代理公司: 42250 武漢泰山北斗專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)
• 代理人: 程千慧

1.一種E2F1蛋白可結(jié)合的DNA片段，其特征在于，包含多個(gè)E2F1蛋白結(jié)合框，每個(gè)所述E2F1蛋白結(jié)合框的序列為5’-TTTSSCGS-3’，其中S表示C或G，每兩個(gè)相鄰的E2F1蛋白結(jié)合框之間具有間隔序列，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.權(quán)利要求1所述的DNA片段在檢測細(xì)胞內(nèi)E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

3.一種用于檢測細(xì)胞內(nèi)E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：將包含權(quán)利要求1所述的DNA片段以及連接于所述DNA片段下游的報(bào)告基因表達(dá)框的報(bào)告基因系統(tǒng)導(dǎo)入所述細(xì)胞；

S2：通過檢測所述報(bào)告基因的表達(dá)來計(jì)算所述細(xì)胞內(nèi)E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述報(bào)告基因系統(tǒng)為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，包括重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，并且所述重組質(zhì)粒帶有所述DNA片段以及連接在所述DNA片段下游的熒光素酶I的表達(dá)框，所述對照質(zhì)粒帶有熒光素酶II的表達(dá)框，所述熒光素酶I與所述熒光素酶II激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長不同。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒通過將所述DNA片段插入至質(zhì)粒pGL3-Basic的Kpn I與Hind I I I位點(diǎn)之間得到。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述對照質(zhì)粒為phRL-TK。

7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，S1具體包括：

S11：將所述細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁，并恢復(fù)形態(tài)；

S12：將所述重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，S2具體包括：

S21：轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時(shí)，洗滌細(xì)胞；

S22：分別檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的熒光素酶I和熒光素酶I I的活性；

S23：將熒光素酶I I活性歸一化熒光素酶I活性得到的值作為衡量E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的指標(biāo)。