[發(fā)明專利]一種產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710196474.1
• 申請(qǐng)日: 2017-03-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106896228A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王海榮;楚國(guó)茹;柴同杰;鐘召兵;李超;陳勇;林曉佳;王方山
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/577
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/577
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè))37240
• 代理人: 李茜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)又稱魏氏梭菌(C.welchii)，廣泛存在于自然環(huán)境中，并見(jiàn)于幾乎所有溫血?jiǎng)游锏南纼?nèi)，屬于人和動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群的成員。產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犢、仔豬、家兔、雛雞的壞死性腸炎、腸毒血癥等疾病，發(fā)病急、死亡率高，是嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病，是近年來(lái)我國(guó)家畜“猝死癥”的主要病原，給各國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生α毒素(CPA)，本菌能引起人類(lèi)氣性壞疽及多種動(dòng)物的腸毒血癥和壞死性腸炎，當(dāng)家畜被感染后其體內(nèi)產(chǎn)生α毒素抗體，因此α毒素抗體是診斷產(chǎn)氣莢膜梭菌病的重要依據(jù)之一。

現(xiàn)有技術(shù)中小白鼠毒素中和試驗(yàn)是檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體的經(jīng)典方法,雖然準(zhǔn)確可靠,但費(fèi)時(shí)、費(fèi)工。而卵磷脂水解抑制試驗(yàn)欠敏感,且重復(fù)性差,操作繁瑣,難于推廣應(yīng)用。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，國(guó)外已經(jīng)出現(xiàn)多種檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體的商品檢測(cè)試劑盒，但價(jià)格昂貴，因此為了彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體檢測(cè)的空白，急切需要建立快速、靈敏、特異并能大批量檢測(cè)的ELISA方法，為產(chǎn)氣莢膜梭菌病診斷、研究提供有效工具。

本發(fā)明的發(fā)明人曾經(jīng)申請(qǐng)過(guò)的專利：“一種A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體的間接ELISA檢測(cè)方法”雖然公開(kāi)了A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，但是由于其檢測(cè)的是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的所有外毒素，特異性差，無(wú)法定性的檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素，因此難以填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白。

發(fā)明內(nèi)容

證實(shí)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述情況，本發(fā)明的發(fā)明人提供了提供了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體的捕獲ELISA檢測(cè)方法，該方法以制備的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素為抗原，一是用來(lái)免疫兔制備高免血清，二是濃縮、純化后作為捕獲ELISA的結(jié)合抗原；檢測(cè)方法包括以下步驟：(1)包被(2)封閉(3)加抗原(4)加待檢樣品(5)加入二抗(6)顯色(7)終止(8)結(jié)果判定。此方法具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、可重復(fù)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，另外此方法可以大批量檢測(cè)樣品，為該病的檢測(cè)和研究提供了有效，簡(jiǎn)便的血清學(xué)診斷方法。

與先前申請(qǐng)的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體的間接ELISA檢測(cè)方法不同，本發(fā)明的方法可以特異性地檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素，準(zhǔn)確率和特異性均比先前技術(shù)有明顯的提高，最終所建立的捕獲ELISA檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體方法可用于大批量樣品檢測(cè)，為畜禽產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷及研究提供了更快速、有效的工具，并為疫苗質(zhì)量和食品安全監(jiān)測(cè)的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明人在本發(fā)明中所采用的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌采用現(xiàn)有菌種，特別選自菌種NCTC528(保藏于National Collection of Type Cultures英國(guó)國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào):NCTC528)，可通過(guò)現(xiàn)有渠道直接獲得，故而該生物材料屬于現(xiàn)有技術(shù)中可直接獲得的材料，不需進(jìn)行單獨(dú)的生物保藏。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案中主要含有如下幾個(gè)特殊之處：

1A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗原的制備:

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌種NCTC528接種于血平板培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)蘇，37℃厭氧培養(yǎng)36h，選取單個(gè)的菌落接種液體硫乙醇培養(yǎng)基增菌12小時(shí)，然后將增菌液按體積百分比5％接種于改良的Gordon湯中，45℃培養(yǎng)5h產(chǎn)毒，將培養(yǎng)物離心后用0.22um蔡氏濾器過(guò)濾除菌，得到除菌后的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素；取其一部分用甲醛滅活免疫家兔，剩余所獲得的外毒素經(jīng)硫酸銨沉淀，再經(jīng)透析袋除鹽，Sephadex-G25柱層析對(duì)外毒素進(jìn)行除鹽純化濃縮，作為捕獲ELISA的捕獲抗原；

獲得上述外毒素之后，發(fā)明人利用LD₅₀實(shí)驗(yàn)測(cè)定所產(chǎn)外毒素的活性。

如上所述，發(fā)明人利用其進(jìn)行了如下的具體應(yīng)用：

(1)甲醛滅活外毒素，得到類(lèi)毒素，與弗氏佐劑乳化，作為免疫家兔的抗原；

(2)硫酸銨沉淀，再經(jīng)透析袋除鹽，Sephadex-G25柱層析對(duì)外毒素進(jìn)行除鹽純化濃縮，作為捕獲ELISA的捕獲抗原。

2.抗產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雜交瘤細(xì)胞的復(fù)蘇及單克隆抗體的制備純化；