[發明專利]一種產氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 201710196474.1
• 申請日: 2017-03-29
• 公開（公告）號: CN106896228A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 王海榮;楚國茹;柴同杰;鐘召兵;李超;陳勇;林曉佳;王方山
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業)37240
• 代理人: 李茜

1.一種產氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測方法，其特征在于：具體步驟為：

(1)包被：將上述獲得的產氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體用抗原包被液稀釋到0.3μg/ml,每孔100μL，加入到96孔酶標板，密封4℃過夜；

(2)封閉：用PBST洗滌液洗滌上述酶標板3次，每次3min，洗滌完成后，加入含5wt％脫脂奶粉的PBST溶液作為封閉液，每孔200μL，4℃封閉過夜；

(3)加抗原：用PBST溶液洗滌上述酶標板3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS稀釋至2ug/ml的捕獲抗原100ul，37℃孵育1h；

(4)加待檢血清：用PBST溶液洗滌3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS緩沖液以1:160體積比稀釋的被檢血清，100μL/孔，同時設置陰陽性和空白對照，PBS緩沖液作為空白對照，37℃孵育1h；

(5)加二抗：用PBST溶液洗滌3次每次3min并拍干，加入用PBS緩沖液按1:8000體積比稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG,37℃孵育1h；

(6)顯色：用PBST溶液洗滌3次每次3min并拍干，最后加入可溶性TMB底物顯色液100μL/孔,37℃條件避光反應15min；

(7)終止：每孔加100ul2M H₂SO₄溶液終止反應，450nm處讀取吸光值；

計算陰性樣品平均值與標準差(SD)，求得為陽性臨界值，為陰性臨界值。運用建立的捕獲ELISA方法測定OD_450nm，為陽性，為陰性，為可疑樣品；

其中所述產氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體獲得方法如下：

將產氣莢膜梭菌α毒素的雜交瘤細胞株F12，保藏于中國微生物菌種保藏中心保藏，保藏編號：CGMCC No.8870，進行常規復蘇、培養；選擇6-8周齡雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式不完全佐劑0.5mL/只致敏，一周后注射陽性雜交瘤細胞株F12,劑量0.5-1×10⁶個/只，7-10天后收集小鼠腹水，得到大量產氣莢膜梭菌α毒素單克隆抗體；

所述捕獲抗原獲得方法如下：

A型產氣莢膜梭菌菌種NCTC528接種于血平板培養基上進行復蘇，37℃厭氧培養36h，選取單個的菌落接種液體硫乙醇培養基增菌12小時，然后將增菌液按體積百分比5％接種于改良的Gordon湯中，45℃培養5h產毒，將培養物離心后用0.22um蔡氏濾器過濾除菌，得到除菌后的A型產氣莢膜梭菌外毒素；取其一部分用甲醛滅活免疫家兔，剩余所獲得的外毒素經硫酸銨沉淀，再經透析袋除鹽，Sephadex-G25柱層析對外毒素進行除鹽純化濃縮，作為捕獲ELISA的捕獲抗原。

2.根據權利要求1所述產氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中的陽性對照血清，獲得方法如下：

選取1.0-1.5Kg健康未接種過疫苗的家兔5只，將甲醛滅活的外毒素2mL和弗氏完全佐劑按照體積1:1混合乳化，背部皮膚多點注射1mg/只；首免兩周后，將滅活的外毒素2mL和弗氏不完全佐劑按照體積1:1混合乳化，注射劑量與方法同上；2周后同種方法進行三免；三免后2周用無佐劑抗原加強免疫，劑量與方法同上，所得高免血清作為捕獲ELISA陽性對照血清。

3.根據權利要求1所述產氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中的陰性對照血清采用與所制高免血清進行同步實驗注射生理鹽水的家兔血清。