[發(fā)明專利]禾谷鐮孢的特異性PCR擴增引物及檢測體系與應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2017-03-28
• 公開（公告）號: CN106868176A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段燦星;葛波;王曉鳴;陳國康;周丹妮;孫素麗;朱振東
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測技術(shù)，具體地說，涉及禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)的特異性PCR擴增引物及檢測體系、含有該引物的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

玉米是我國最重要的糧食作物之一，隨著食品工業(yè)和飼料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，玉米作為主要食品和飼料作物的地位也日益上升。穗腐病是玉米生產(chǎn)上的重要病害，由多種病原真菌引起，不僅直接造成玉米產(chǎn)量損失，而且籽粒中的致病菌還能夠產(chǎn)生多種真菌毒素，如單端孢霉烯、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮等，導(dǎo)致玉米品質(zhì)下降，給食品與飼料帶來重大的安全隱患，威脅到人畜健康。

鐮孢菌(Fusarium spp.)是玉米生產(chǎn)上常見的病原真菌類群之一，能夠在玉米的根、莖、葉、果上引發(fā)嚴(yán)重的病害，造成巨大的經(jīng)濟損失。大量研究表明，鐮孢菌是引起玉米穗腐病最重要的病原菌，此外，還會引起玉米的莖腐病、鞘腐病、頂腐病、根腐病、苗枯病等病害。主要致病鐮孢種包括禾谷鐮孢復(fù)合種、擬輪枝鐮孢、層出鐮孢、尖鐮孢復(fù)合種、黃色鐮孢、木賊鐮孢等。研究發(fā)現(xiàn)，美國、加拿大、德國、奧地利、尼泊爾、巴西、阿根廷等地的玉米穗腐病致病鐮孢主要為禾谷鐮孢復(fù)合種，而加拿大、德國、巴西、阿根廷、法國、意大利、尼羅地亞、尼泊爾、南非、伊朗等地的致病鐮孢主要為擬輪枝鐮孢，層出鐮孢則主要分布在德國、巴西、尼泊爾以及阿根廷西北部。在我國，禾谷鐮孢復(fù)合種主要分布于山西、陜西、甘肅、云南、貴州、東北及黃淮地區(qū)，擬輪枝鐮孢主要分布于東北、北京、河北、河南、山東、安徽、四川、湖南、湖北等地，其他致病種也有少量分布。由此可見，禾谷鐮孢分布地區(qū)較廣，是許多地區(qū)玉米穗腐病的優(yōu)勢致病菌。

由于鐮孢菌在自然界中分布非常廣泛，種類多，形態(tài)變異大，而傳統(tǒng)鐮孢菌分離以形態(tài)學(xué)上差異劃分組、種，以不同寄主或不同品種的致病力差異作為專化型或生理小種的鑒定手段，給鐮孢菌的識別和鑒定工作帶來了一定的困難。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)及其相關(guān)分子檢測技術(shù)已廣泛用于植物病原菌消長動態(tài)的分子檢測與預(yù)警，對于鐮孢種屬的概念在認(rèn)識上發(fā)生了很大變化，對鐮孢菌分類更接近于自然親緣關(guān)系，因此，開發(fā)不同鐮孢種特異的分子標(biāo)記，對于準(zhǔn)確鑒定鐮孢種具有較大的應(yīng)用價值。

β微管蛋白(β-tubulin)基因廣泛存在于真核生物中，目前尚無針對該靶基因設(shè)計的特異性禾谷鐮孢檢測引物的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種可快速、準(zhǔn)確地檢測禾谷鐮孢的特異性PCR擴增引物和檢測體系以及含有該引物的試劑盒。

本發(fā)明的另一目的是提供上述引物及試劑盒在檢測禾谷鐮孢中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明從Fusarium Center's database at Penn State數(shù)據(jù)庫中下載禾谷鐮孢(F.graminearum)的β微管蛋白(β-tubulin)基因序列(KM373925.1)，分析了禾谷鐮孢與其他鐮孢種在β-tubulin基因序列上的差異(圖1)，發(fā)現(xiàn)了數(shù)個高度特異且只存在于禾谷鐮孢中的位點，利用Primer 5軟件設(shè)計出一系列用于特異檢測禾谷鐮孢的引物，從中篩選出特異性最強的引物Fg18TF/Fg18TR，并設(shè)計了巢式外引物HW18TF/HW18TR來提高靈敏度。在此基礎(chǔ)上建立了檢測禾谷鐮孢的PCR反應(yīng)體系。

本發(fā)明提供的禾谷鐮孢特異性PCR擴增引物，包括(Seq ID No:1-4)：

正向引物Fg18TF：5’-TTGTAAGTGTTTTCCTCTGACCT-3’

反向引物Fg18TR：5’-AGAAAGCAGCACCGATTTGG-3’；以及

正向巢式外引物HW18TF：5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGTG TT-3’

反向巢式外引物HW18TR：5’-TAAACACCATTGCTGTCGAGA-3’

本發(fā)明還提供含有上述PCR引物的用于檢測禾谷鐮孢的試劑盒。

前述試劑盒中還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板等中的至少一種。

本發(fā)明還提供上述PCR引物或試劑盒在檢測禾谷鐮孢中的應(yīng)用，包括以下步驟：

1)提取樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR進行單輪PCR擴增反應(yīng)；或者，