[發明專利]禾谷鐮孢的特異性PCR擴增引物及檢測體系與應用

在審

• 申請號: 201710194078.5
• 申請日: 2017-03-28
• 公開（公告）號: CN106868176A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 段燦星;葛波;王曉鳴;陳國康;周丹妮;孫素麗;朱振東
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

1.禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)的特異性PCR擴增引物，其特征在于，包括：

正向引物Fg18TF：5’-TTGTAAGTGTTTTCCTCTGACCT-3’

反向引物Fg18TR：5’-AGAAAGCAGCACCGATTTGG-3’；以及

正向巢式外引物HW18TF：5’-AACATGCGTGAGATTGTAAGTG TT-3’

反向巢式外引物HW18TR：5’-TAAACACCATTGCTGTCGAGA-3’。

2.含有權利要求1所述引物的用于檢測禾谷鐮孢的試劑盒。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應緩沖液、標準陽性模板中的至少一種。

4.權利要求1所述引物或權利要求2或3所述試劑盒在檢測禾谷鐮孢中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR進行單輪PCR擴增反應；或者，

當模板DNA濃度過低導致無法擴增出條帶時，采用巢式PCR；先利用巢式外引物HW18TF和HW18TR進行第一輪PCR擴增反應，然后取1～2μL擴增產物作為模板，利用引物Fg18TF和Fg18TR進行第二輪PCR擴增反應；

3)分析PCR擴增產物。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，PCR反應體系為：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反應緩沖液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL。

7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，進行單輪PCR擴增反應以及巢式PCR中第二輪PCR擴增反應，所采用的反應程序為：94℃5min；95℃50s，58℃50s，72℃1min，35個循環；72℃10min；

巢式PCR中第一輪PCR擴增反應，所采用的反應程序為：94℃5min；95℃50s，56℃50s，72℃1min，35個循環；72℃10min。

8.根據權利要求5-7任一項所述的應用，其特征在于，對PCR擴增產物進行1～2％瓊脂糖凝膠電泳，如果電泳檢測結果出現大小為291bp的特征條帶，則表明樣品中含有禾谷鐮孢。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述樣品為含有禾谷鐮孢的菌絲、分生孢子的樣品。

10.禾谷鐮孢的特異性PCR檢測體系，其特征在于，包括：1U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，10×PCR反應緩沖液1.0μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μmol/L正向、反向引物各0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 6.25μL；

其中，正向、反向引物的定義同權利要求1所述。