[發明專利]一種檢測玉米赤霉烯酮免疫親和凝膠檢測柱及其制備方法

在審

• 申請號: 201710190689.2
• 申請日: 2017-03-28
• 公開（公告）號: CN108663515A
• 公開（公告）日: 2018-10-16
• 發明（設計）人: 生威;王碩;張燕;吳賀森;李詩潔;劉越;劉冰
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: G01N33/559
• 分類號: G01N33/559
• 代理公司: 天津合志慧知識產權代理事務所(普通合伙) 12219
• 代理人: 陳松

本發明提供了一種可視化快速檢測食品中生物毒素玉米赤霉烯酮的免疫親和凝膠檢測柱的制備方法。以瓊脂糖凝膠為固相載體，將玉米赤霉烯酮抗體和溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯制備抗體膠作為檢測層，將HRP抗體與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯制備HRP抗體膠作為質控層，裝入1mL的固相萃取柱，制備免疫親和凝膠檢測柱。本發明研制了一種新型快速定性半定量檢測食品中生物毒素玉米赤霉烯酮的免疫親和凝膠柱檢測產品，檢測限為5μg/L。發明具有以下突出的優點：1、特異性高，靈敏度好；2、樣品前處理簡單；3、檢測耗時短，準確性高；4、操作簡便，不需要大型儀器的輔助。

技術領域

本發明屬于小分子化合物免疫化學和殘留分析技術領域，涉及免疫化學、酶學與分析化學技術等，尤其是涉及一種玉米赤霉烯酮免疫親和凝膠可視化檢測柱的制備。

背景技術

玉米赤霉烯酮主要由禾谷鐮刀菌產生，粉紅鐮刀菌、串珠鐮刀菌、三線鐮刀菌等多種鐮刀菌也能產生這種毒素。1980年，李季倫教授首次證實了玉米赤霉烯酮存在于植物體內，這一現象吸引了科研人員重視。幾十年來，研究人員已經在玉米、小麥、燕麥和大麥等農作物中發現了玉米赤霉烯酮污染的蹤跡。目前，食品中玉米赤霉烯酮的檢測方法主要有微生物法、高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析(TLC)法、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)、高效毛細管電泳法(HPCE)、免疫分析法(IA)等。其中高效液相色譜法是廣泛應用的確證方法，方法準確性高，但是前處理方法繁瑣，需要昂貴的儀器以及專業的操作人員，檢測費用昂貴，不適合進行現場快速檢測。因此，研制一種靈敏度高、操作簡便的真菌毒素快速檢測手段勢在必行。免疫檢測方法，可有效避免樣品處理，儀器等因素的制約，而且方法的特異性強，靈敏度高，甚至可以制成試紙用于現場快速檢測。然而試紙條檢測也易受樣品基質的影響，在不同食品樣品檢測中受到一定限制。本發明闡述的凝膠柱免疫檢測產品為某些顏色較深及基質影響較大的樣品中的玉米赤霉烯酮的檢測分析提供一種行之有效的可視化定性半定量快速簡單的檢測方法，為食品安全的有力監管提供可靠的技術保障。

發明內容

本發明提出一種可以定性半定量的檢測食品中的玉米赤霉烯酮的簡單、省時、靈敏的可視化免疫親和凝膠檢測柱的制備。只要樣品中含有酶標記抗原，凝膠檢測柱的質控層就會出現藍色，它可以確保檢測柱可以正常檢測，達到質控的作用。以凝膠檢測柱的質控層為基準，通過檢測層顏色深淺變化達到定性或半定量檢測食品樣品中的玉米赤霉烯酮的目的。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

封閉膠的制備

(1)溶脹：稱取1.00g溴化氰活化瓊脂糖凝膠，加入到80mL的配制好的HCl溶液中，攪拌溶脹10min(溶脹后膠的終體積約為3.5mL)。

(2)淋洗：將溶脹好的瓊脂糖凝膠轉移到具砂板層析柱中，再加入200mL HCl淋洗，然后用偶聯緩沖液沖洗柱子，調節柱子pH至中性。

(3)封閉：加入9mL甘氨酸封閉液，密封柱子，室溫下震蕩反應2h。

(4)清洗：首先加入10mL的偶聯緩沖液淋洗一次，然后用10mL的醋酸鈉緩沖溶液和10mL的偶聯緩沖液分別沖洗3遍。

(5)貯存：待清洗液抽空，制備好的封閉膠用PBS懸起，約10mL PBS(含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。

玉米赤霉烯酮抗體膠和HRP抗體膠的制備

(1)溶脹：準確稱取0.50g溴化氰活化瓊脂糖凝膠，加入到40mL的配制好的HCL溶液中，攪拌溶脹10min(溶脹后膠的終體積約為1.8mL)。

(2)淋洗：將溶脹好的瓊脂糖凝膠轉移到在具砂板層析柱中，再加入200mL HCL淋洗，然后用偶聯緩沖液沖洗柱子，調節柱子pH至中性，將淋洗液全部淋完。