[發明專利]一種纖連蛋白和功能細胞復合型微囊化移植體的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201710190208.8
• 申請日: 2017-03-28
• 公開（公告）號: CN106963782A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 王斌;桑喜成;張世陽;許義輝;賈秀秀;楊敏祺
• 申請（專利權）人: 王斌
• 主分類號: A61K35/39
• 分類號: A61K35/39;A61K35/34;A61K35/44;A61K38/39;A61K47/34;A61K47/36;A61K9/50;A61P9/00;A61P3/10;C12N5/071;C12N5/077
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司41110
• 代理人: 姜振東

1.一種纖連蛋白和功能細胞復合型微囊化移植體的制備方法，其特征在于：包括以下工藝步驟：

（1）功能細胞供體的選擇：從人或SPF哺乳動物獲得功能細胞供體；

（2）功能細胞的分離純化：在無菌條件下，獲得供體內功能細胞所在的目標組織，針對不同功能細胞的特性利用機械分離法、膠原酶消化法、不連續密度梯度離心法方法，從目標組織中分離純化出具有特定功能的組織功能細胞；

（3）功能細胞的規模化擴增：利用FN無血清培養基，將純化后的功能細胞進行體外培養，利用FN對細胞增殖、生長、分化等細胞再生修復的生物學特性，在5-7天內擴增出大量的純度≧95%，存活率≧93%的活性功能細胞；

（4）纖連蛋白和功能細胞復合微囊化：利用微囊化免疫隔離技術將一定比例的纖連蛋白和步驟（3）擴增后的功能細胞共同包埋于APA微囊內，形成纖連蛋白和功能細胞復合型微囊化移植體。

2.根據權利要求1所述的纖連蛋白和功能細胞復合型微囊化移植體的制備方法，其特征在于：步驟（1）中所述的功能細胞包括人或哺乳動物體的骨髓、心臟、胰腺或其它組織來源的心肌細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞及骨髓間充質干細胞、胰島細胞、胰島干細胞中的一種或幾種。

3.根據權利要求1所述的纖連蛋白和功能細胞復合型微囊化移植體的制備方法，其特征在于：FN無血清培養基的具體配方如下：每1000mlRPMI1640或DMEM/F12培養液，加入纖連蛋白（FN）50-80mg，青霉素100kU和鏈霉素100kU。

4.根據權利要求1所述的纖連蛋白和功能細胞復合型微囊化移植體的制備方法，其特征在于：包埋于APA微囊內的纖連蛋白和功能細胞的比例為1∶40-50。

5.根據權利要求1所述的纖連蛋白和功能細胞復合型微囊化移植體的制備方法，其特征在于：所述的胰島細胞的分離純化及鑒定方法具體步驟如下：

（1）胰島分離：無菌條件下，從SPF哺乳動物幼崽體內解剖出胰腺，并灌注體積約為胰腺重量2倍的由Hanks液配置的膠原酶溶液，37℃水浴消化30 min，用4℃冷Hanks液終止消化，充分混勻后，用40目不銹鋼濾網過濾，收集消化后的組織，4℃離心，Hanks液洗滌2次，去除脂肪等雜質細胞，取樣鏡檢計數盒觀察消化后胰島分離情況；

（2）胰島純化：通過不連續密度梯度離心，得到胰島細胞，分別取樣鏡檢，觀察胰島形態、數量、純度和活性；

（3）胰島計數：取純化后胰島細胞懸浮液用雙硫腙（DTZ）染色后，在顯微鏡下計數直徑50 μm以上的胰島，計數100-450 μm各數量級的胰島細胞數，以直徑為150 μm為基準系數1，計數胰島當量（IEQ），重復取樣3次，并求出平均值；

（4）胰島純度測定：純化后的胰島計數時，用倒置顯微鏡下總面積中的胰島面積所占的比例測算純度；

（5）胰島細胞活性鑒定：取0.1mL胰島細胞懸液，采用吖啶橙（AO）與碘丙啶（PI）熒光染色，熒光顯微鏡下計數紅綠染色的細胞數，計算細胞的活性。