[發(fā)明專利]一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710187011.9
• 申請(qǐng)日: 2017-03-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106938058A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊渝江;劉鈞;林海;王啟光;孫勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): A61L27/36
• 分類號(hào): A61L27/36;A61L27/24;A61L27/50;A61L27/52
• 代理公司: 成都九鼎天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司51214
• 代理人: 錢成岑

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于脫細(xì)胞支架組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

脫細(xì)胞支架是常見(jiàn)的組織工程支架。脫細(xì)胞支架的來(lái)源主要有天然組織和體外組織工程。但是都存在一些問(wèn)題。由于來(lái)源問(wèn)題，人源天然組織比較少見(jiàn)。大多采用異種來(lái)源，豬眼角膜，牛心包等產(chǎn)品都非常常見(jiàn)。但是，異種來(lái)源的組織，更加容易出現(xiàn)排斥反應(yīng)。體外組織工程也可以獲得滿足一定功能的組織，比如脂肪、軟骨、骨，相比天然來(lái)源更加容易獲得和大批量生產(chǎn)。脫細(xì)胞是制備脫細(xì)胞支架最關(guān)鍵的一步，細(xì)胞的脫除和基質(zhì)以及生物因子的保存都非常重要。過(guò)分脫細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)和因子被破壞，無(wú)法保留脫細(xì)胞支架的生物學(xué)性能。細(xì)胞脫除不干凈，殘余的DNA等物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致排斥反應(yīng)。常見(jiàn)的手段，就是將天然組織或者組織工程獲得的組織破碎成小塊，再進(jìn)行脫細(xì)胞處理。破碎過(guò)程的發(fā)熱和機(jī)械力會(huì)導(dǎo)致包括生物因子的基質(zhì)和微細(xì)結(jié)構(gòu)變性或者被破壞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法，通過(guò)直接制備包裹細(xì)胞的膠原凝膠微球，在體外培養(yǎng)得到微米級(jí)的組織塊。在快速得到大量微米級(jí)組織的同時(shí)，能避免后續(xù)的破碎過(guò)程，可以直接進(jìn)行脫細(xì)胞操作，更好的保留了組織中的基質(zhì)以及微細(xì)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法，包括細(xì)胞-膠原混合液的制備，細(xì)胞-膠原凝膠微球的制備以及脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備。

作為本發(fā)明一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個(gè)具體實(shí)施例，所述細(xì)胞-膠原混合液的制備為：將膠原溶液pH調(diào)節(jié)至6.5～7.5，并將細(xì)胞懸液均勻混合到膠原溶液中即得細(xì)胞-膠原混合液；所述細(xì)胞-膠原凝膠微球的制備為：將細(xì)胞-膠原混合液加入到油相溶液中，生成穩(wěn)定懸浮液后，提供合適的成膠條件使微球凝膠化，然后經(jīng)離心或過(guò)濾收集、清洗后即得細(xì)胞-膠原凝膠微球。

作為本發(fā)明一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個(gè)具體實(shí)施例，所述脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備為：將上述制備的細(xì)胞-膠原凝膠微球在體外培養(yǎng)后收集所需的膠原凝膠微球，在液氮及水中反復(fù)冷凍-溶解1～10次，經(jīng)清洗Ⅰ、震蕩Ⅰ后將膠原凝膠微球加入到DNAse1的水溶液中震蕩1～24h，最后經(jīng)清洗Ⅱ、戊二醛處理及培養(yǎng)基清洗即得脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架。本步驟中將DNAse1的處理時(shí)間設(shè)定為1～24h小時(shí)，是因?yàn)楫?dāng)處理時(shí)間大于24小時(shí)會(huì)對(duì)基質(zhì)造成很大的破壞。

作為本發(fā)明一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個(gè)具體實(shí)施例，所述戊二醛處理后還包括酒精浸泡及超聲處理，最后再用培養(yǎng)基清洗。

作為本發(fā)明一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個(gè)具體實(shí)施例，所述液氮及水中反復(fù)冷凍-溶解前還包括用加有蛋白酶抑制劑的去離子水將凝膠微球清洗1～6次。

作為本發(fā)明一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個(gè)具體實(shí)施例，所述水的溫度為25～37℃；所述清洗Ⅰ為用0.1％～2％的Triton X-100水溶液中清洗1～3次；所述震蕩Ⅰ為在100～1000rpm轉(zhuǎn)速下震蕩1～60min。

作為本發(fā)明一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個(gè)具體實(shí)施例，所述DNAse1的水溶液中DNAse1的濃度為10～500units/mL；所述DNAse1的水溶液中震蕩溫度為20～37℃，轉(zhuǎn)速為10～140rpm，并間隔0.5～12h更換一次新鮮DNAse1溶液，每次更換DNAse1溶液前用0.05％～2％的Triton X-100水溶液清洗0～5min。

作為本發(fā)明一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的制備方法的一個(gè)具體實(shí)施例，所述清洗Ⅱ?yàn)椴捎肊DTA溶液清洗0～10次；所述戊二醛處理為采用0.1％戊二醛處理0～24小時(shí)；所述酒精浸泡為采用用75％酒精浸泡0～1小時(shí)；所述超聲處理時(shí)間為0～10min。

本發(fā)明還提供一種脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架，所述膠原凝膠微球支架采用上述制備方法制備得到。

本發(fā)明還提供所述脫細(xì)胞膠原凝膠微球支架的應(yīng)用，所述脫細(xì)胞凝膠微球支架在軟骨及軟骨下骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：