[發明專利]一種快速檢測褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性的方法

有效

• 申請號: 201710186158.6
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN107475360B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 劉澤文;張懿熙;劉美玲
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6888
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明基于環介導恒溫擴增技術(LAMP)建立一種褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性的快速檢測方法，屬于抗藥性綜合治理和褐飛虱綜合防治范疇。該檢測方法通過在褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗性靶標變異個體(A302S)的γ?氨基丁酸受體(GABA receptor)上設計2對特異性引物，進行LAMP擴增，根據反應產物顏色判定是否為褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑的抗性個體。其特征在于如下步驟實現：提取單頭褐飛虱2?3齡若蟲基因組DNA；所使用的特異性引物；LAMP反應體系；LAMP反應程序；擴增產物的顏色檢測。該方法穩定性高、周期短、靈敏度高，適合褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗性的早期檢測。

技術領域本發明建立了一種基于環介導恒溫擴增技術(LAMP)快速檢測褐飛虱對苯基吡唑類殺蟲劑抗藥性的方法，屬于生物方法領域，用于褐飛虱對作用于昆蟲γ-氨基丁酸受體(GABA receptor)的殺蟲劑(包括氟蟲腈、乙蟲腈和丁烯氟蟲腈)抗性靶標變異(A302S)的高靈敏、快速分子檢測。

背景技術我國是世界上農林生物災害發生最嚴重的國家之一，生物災害發生頻繁，為害嚴重，損失巨大。我國常見農作物有害生物有1000多種，其中可造成嚴重危害的近100種，年發生面積達70億畝次。如蝗蟲、稻飛虱、稻縱卷葉螟、小麥條銹病、稻瘟病的暴發頻率較高，對農業生產威脅很大，每年經過大力防治，挽回糧食損失1800億斤左右，但仍損失糧食近500億斤，防控任務十分繁重。有害生物抗藥性快速增長，目前至少有30種農作物害蟲對40種殺蟲劑、20多種病原菌對各類現代選擇性殺菌劑產生了不同程度的抗藥性。病蟲抗藥性的暴發往往導致防治失敗，如果補救防治不及時或不到位，將造成嚴重的經濟損失，抗藥性的產生同時導致更多的化學農藥投入田間，對環境造成嚴重污染，對有益生物造成毀滅性的殺傷。我國每年因使用農藥引起的中毒人數超過9萬人；發生作物藥害的面積約300萬畝。由于化學農藥過度和不當使用，不僅造成嚴重的生態環境污染(高達80％的農藥漂移或流失到非靶標生物、土壤和水域中)，而且成為農產品質量安全的隱患。農藥殘留和重金屬污染超標是當前農產品質量安全的突出問題，已經成為國際市場對我國農產品設置綠色貿易壁壘的主要依據。

水稻是我國第一大糧食作物，常年播種面積4.77億畝左右，占糧食播種面積的30％，總產量約2億噸，產量占糧食總產的40％左右。水稻主要害蟲，褐飛虱、二化螟等，成為威脅水稻產量的主要因素之一，全國農作物病蟲測報網監測調查和專家會商分析，2017年農作物病蟲害呈重發趨勢，預計發生面積比上年增加9.7％，稻飛虱在長江流域及其以南大部稻區偏重或大發生，發生面積比上年增加27.5％，發生面積13.9億畝次，其中，蟲害發生面積9.5億畝次，病害發生面積4.4億畝次；抗藥性的上升及由此導致的大量化學農藥的使用，同時威脅著水稻品質和農業生產安全。隨著2005-2006年褐飛虱對吡蟲啉高抗性的產生，氟蟲腈隨著大量應用；由于氟蟲腈對于蜜蜂及水生生物具有較高毒性，我國從2009年10月1日起已禁用，基于氟蟲腈基礎上開發的新型農藥丁烯氟蟲腈投入使用，丁烯氟蟲腈在我國目前在螟蟲的防治上登記使用，王鵬在2011-2012年監測褐飛虱對丁烯氟蟲腈的抗藥性，結果表明，我國8省(市)的18個褐飛虱種群中，對丁烯氟蟲腈的抗性倍數為1.0-7.3倍，為敏感-低水平抗性，與往年監測結果無明顯差異。

環介導恒溫擴增反應(LAMP)是日本學者Notomi等發明的一種新穎的恒溫核酸體外擴增技術，廣泛應用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術原理是：利用一套(4種)特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環鏈置換反應，60-65℃范圍30-80min內，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產物——白色的焦磷酸鎂沉淀產生。羥基萘酚藍(HNB)是一種金屬離子指示劑，根據反應液中鎂離子的變化而呈現出不同的顏色，陰性(沒有擴增出產物)時為紫色，陽性(有產物擴增)時為藍色。LAMP方法的最大特點就是實現恒溫擴增，不需要循環儀、凝膠成像系統等昂貴的儀器；擴增反應極快，一般在1小時內完成；擴增產生的產物量大，通過肉眼即可判定結果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度高、特異性強；操作簡便、快捷，極適于昆蟲突變基因型的快速鑒定及檢測。