[發明專利]用于水產動物源細菌磺胺類藥物耐藥基因三重熒光定量PCR檢測的引物、探針及其使用方法

在審

• 申請號: 201710181549.9
• 申請日: 2017-03-24
• 公開（公告）號: CN106868168A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 韋信賢;童桂香;黎小正;黃國秋;陳靜;吳明媛;蘭柳春;楊姝麗
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水產科學研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于磺胺類藥物耐藥基因檢測技術領域，尤其涉及用于水產動物源細菌磺胺類藥物耐藥基因三重熒光定量PCR檢測的引物、探針及其使用方法。

背景技術

細菌性疾病是中國水產養殖動物的主要病害，其造成水產養殖動物的損失占全部病害損失的50％以上。在水產養殖過程中，使用各種抗菌素類藥物抑制或者殺滅致病菌是防治水產養殖動物細菌性疾病最有效的手段。磺胺類藥物作為主要的漁用抗菌藥具有抗菌譜廣、藥效顯著、價格低、易儲存等優點，是目前各水產養殖場的必備藥物。國內大量研究結果表明，水產動物源細菌對磺胺類藥物已經產生了廣泛的耐藥性。臨床上細菌對磺胺類藥物的抗性主要是由質粒上對磺胺類藥物親和力更低的新二氫葉酸合成酶(即具有抗性的DHPS)所介導，且耐藥質粒可通過轉化、易位、接合等方式在細菌之間進行轉移，使R^-細菌從R⁺細菌中獲得這種抗性。對磺胺類藥物具有抗性的DHPS共有3種，其對應的編碼基因分別被命名為Sul1、Sul2和Sul3，對這3個基因的檢測能反映細菌對磺胺類藥物的耐藥情況。

中國目前臨床上對細菌磺胺類藥物耐藥性的檢測主要采用傳統的藥敏試驗方法，這些方法耗時長、準確性差、靈敏度低、穩定性不強，已不能滿足臨床上快速、準確篩選敏感藥物的需要。鑒于此，國內已有學者將PCR技術應用于磺胺類藥物耐藥性的快速檢測和耐藥基因的分子流行病學調查。熒光定量PCR不僅有常規PCR技術擴增效率高的特點，還具有探針的高度特異性、光譜技術的高敏感性和精確性等特點，且能定量，不易受到污染，被廣泛運用于醫療、藥物研究及病原菌檢測。多重PCR技術能夠在一個PCR體系中同時檢測多個目標基因，其快速、高效及低成本等特點具有十分廣泛的應用前景。目前，有關磺胺類藥物耐藥基因熒光定量PCR檢測方法的報道尚少。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供用于水產動物源細菌磺胺類藥物耐藥基因三重熒光定量PCR檢測的引物、探針及其使用方法，以實現快速、簡便、準確地進行磺胺類藥物耐藥性的快速檢測和耐藥基因的調查提供技術支持。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

用于水產動物源細菌磺胺類藥物耐藥基因三重熒光定量PCR檢測的引物和探針，包括分別針對水產動物源細菌磺胺類藥物耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3的三組引物和探針，三組引物和探針分別具有以下堿基序列：

Sul1-F CTCGGTGTCGCGGAAATC，

Sul1-R CGCTGGACCCAGATCCTTT，

Sul1-P CGCCACCGTTGGCCTTCCTG；

Sul2-F TGGTGTGGCCTATCTCAATGAT，

Sul2-R GGCAGATGATTTCGCCAATT，

Sul2-P TTCGCGGTTTTCCAGACGCTGC；

Sul3-F CAACGCCCACTTCAGTTGTATC，

Sul3-R TCTGCATTTGGTTGAAGATGGA，

Sul3-P AAGCGGCTCCCAAATCAATCACATCTG。

探針Sul1-P、Sul2-P、Sul3-P的5’端分別標記有熒光報告基團FAM、HEX、CY5，3’端均標記有熒光淬滅基團BHQ1。

三組引物和探針的摩爾比為Sul1-F∶Sul1-R∶Sul1-P∶Sul2-F∶Sul2-R∶Sul2-P∶Sul3-F∶Sul3-R∶Sul3-P＝6∶6∶3∶4∶4∶2∶4∶4∶2。

上述用于水產動物源細菌磺胺類藥物耐藥基因三重熒光定量PCR檢測的引物和探針的使用方法，在三重熒光定量PCR中擴增水產動物源細菌磺胺類藥物耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3。

三重熒光定量PCR的反應體系和反應程序為：

反應體系為：Premix Ex Taq(2×)18μL，ROX Reference Dye II 0.5μL，20μmol/L Sul1上、下游引物(Sul1-F/Sul1-R)均為0.9μL，10μmol/L Sul1探針(Sul1-P)用量為0.9μL，20μmol/L Sul2和Sul3的上、下游引物(Sul2-F/Sul2-R、Sul3-F/Sul3-R)均為0.6μL，10μmol/L Sul2和Sul3探針(Sul2-P、Sul3-P)用量均為0.6μL，模板3μL，用滅菌ddH₂O補足至30μL；