[發(fā)明專利]一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途

在審

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• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN106834516A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 何洪彬;趙貴民;侯佩莉;王洪梅
• 申請（專利權(quán)）人: 山東師范大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司37221
• 代理人: 王志坤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途。

背景技術(shù)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella mutocida，Pm)是引起多種畜禽巴氏桿菌病的革蘭氏陰性病原菌，一般寄生于動物的上呼吸道，具有條件致病性，在某些應(yīng)激條件刺激下，可引起帶菌動物發(fā)生出血性敗血病或呼吸系統(tǒng)疾病。家畜中以牛、豬、兔、綿羊發(fā)病較多，山羊、鹿、駱駝、馬、驢、犬、貓和水貂等亦可感染發(fā)病。禽類中以雞、火雞和鴨最易感，鵝、鴿次之。根據(jù)莢膜抗原的特異性，可將Pm分為5個血清型(A、B、D、E、F)。在我國，引起禽和豬巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清A型Pm，引起牛的主要為莢膜A型和B型Pm，莢膜A型主要表現(xiàn)為牛纖維素性化膿性肺炎，莢膜B型主要表現(xiàn)為牛出血性敗血癥。由于Pm可以在同種或不同種動物間互相傳染，對養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重。

多殺性巴氏桿菌病主要通過呼吸道和消化道傳播，在養(yǎng)殖場環(huán)境中病畜、病禽的排泄物、分泌物及帶菌動物將多殺性巴氏桿菌排向環(huán)境，細菌漂浮在空氣中，形成病原氣溶膠，健康動物經(jīng)呼吸道吸入多殺性巴氏桿菌氣溶膠后即可感染。由于巴氏桿菌病原血清型復(fù)雜，各型之間沒有交叉保護性，疫苗防控本病難度較大，通過定期監(jiān)測，結(jié)合衛(wèi)生消毒及生物安全等可有效預(yù)防本病的發(fā)生。

多殺性巴氏桿菌病的病原學(xué)診斷方法主要有細菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、動物回歸試驗等，但這些方法費時、操作繁瑣、準(zhǔn)確率低，不適合臨床快速診斷和監(jiān)測的需要，很難做到早期預(yù)警和隱性感染牛的篩查。

以環(huán)境氣溶膠樣本為監(jiān)測對象，應(yīng)用靈敏、特異和快速的Real-Time PCR方法可以有效地進行群體監(jiān)測，并對牛場衛(wèi)生消毒和生物安全效果進行評估。但由于多殺性巴氏桿菌氣溶膠中細菌的含量很低，對檢測方法的靈敏度要求很高，再加之氣溶膠樣本的采集相對較困難，因此，目前還未有針對多殺性巴氏桿菌氣溶膠采用TaqMan技術(shù)進行檢測的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示。

具體序列如下：

正向引物：5′-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTG-3′；(SEQ ID NO.1)

反向引物：5′-GACAAGGAAATATAAACCGGCAAA-3′；(SEQ ID NO.2)

探針：5′-(Cy5)TCCTTGACAACGGCGCAACTGATTG(BHQ-2)-3′(SEQ ID NO.3)。

第二方面，本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合。

進一步的，該試劑盒中還包括：陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、陰性對照和實時熒光定量PCR(qPCR)試劑。

所述陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒由含有如SEQIDNo.4所示(241個堿基)的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成；具體如下：

5'-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGCCGGTTTATATTTCCTTGTCAGTCTGATTTATCAATATTTCCATGTTGAGTTACGTTTCTTATGGCCATTATTGAAGCCATTAACGACAGAGCGGTTTAATTTATTTATCGTGTATTGGTTACCTATTTTGGTCTTTTCTTCGTGTTCCAACGGTTTAAT-3'；(SEQ ID NO.4)

所述陰性對照為pEASY-Y3空載質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

所述實時熒光定量PCR(qPCR)試劑為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)試劑。

第三方面，本發(fā)明提供一種非診斷目的的檢測環(huán)境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的方法，步驟如下：

(1)采集環(huán)境氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA；