[發明專利]一種檢測環境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒及用途

在審

• 申請號: 201710178812.9
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN106834516A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 何洪彬;趙貴民;侯佩莉;王洪梅
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 王志坤

1.一種用于檢測環境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探針；其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探針序列如SEQ ID NO.3所示。

2.權利要求1所述的引物和探針組合在制備環境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌檢測的試劑盒、芯片和/或擴增反應試劑中的用途。

3.一種檢測環境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含權利要求1所述的引物和探針組合。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括：陽性標準質粒、陰性對照和實時熒光定量PCR(qPCR)試劑。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性標準質粒由含有如SEQ ID No.4所示的核苷酸片段構成的pEASY-T3重組質粒組成。

6.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為pEASY-Y3空載質粒標準品。

7.一種非診斷目的的檢測環境氣溶膠樣本中多殺性巴氏桿菌的方法，步驟如下：

(1)采集環境氣溶膠樣本；

(2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA；

(3)以提取的基因組總DNA為模板，采用上述的試劑盒進行擴增，根據擴增體系的擴增曲線對環境氣溶膠樣本中是否含有多殺性巴氏桿菌進行判斷，擴增曲線Ct值≤37.0時，擴增曲線成S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有多殺性巴氏桿菌病原核酸，檢測結果為陽性；當擴增曲線Ct值＞37.0時，擴增曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有多殺性巴氏桿菌病原核酸，檢測結果為陰性。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，采集環境氣溶膠樣本的方法為：采用國際標準的全玻璃液體沖擊式采樣器，以30mL含0.01％牛血清白蛋白的PBS

(pH7.0)為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集30min，收集養殖場環境中的氣溶膠樣本。

9.如權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，擴增反應體系為20μL，包括2×Probe qPCR Mix 10μL，模板1μL，10μmol/L的正向引物和反向引物各0.8μL，Probe 0.6μL，RNase Free ddH₂O 6.8μL。

10.如權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟(3)中，擴增反應的條件為：預變性95℃30s，然后95℃變性5s、61℃退火延伸30s進行45個循環，每個循環結束后采集熒光信號，最后40℃30s反應結束。