[發明專利]用于現場快速檢測多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201710178429.3
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN106811541A
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 何洪彬;趙貴民;侯佩莉;王洪梅;何成強
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 王志坤

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體涉及一種應用重組酶聚合酶擴增-側流層析試紙條技術，用于現場快速檢測多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒。

背景技術

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella mutocida，Pm)是引起多種畜禽巴氏桿菌病的革蘭氏陰性病原菌，一般寄生于動物的上呼吸道，具有條件致病性，在某些應激條件刺激下，可引起帶菌動物發生以出血性敗血病或呼吸系統疾病。家畜中以牛、豬、兔、綿羊發病較多，山羊、鹿、駱駝、馬、驢、犬、貓和水貂等亦可感染發病。禽類中以雞、火雞和鴨最易感，鵝、鴿次之。根據莢膜抗原的特異性，可將Pm分為5個血清型(A、B、D、E、F)。在我國，引起禽和豬巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清A型Pm，引起牛的主要為莢膜A型和B型Pm，莢膜A型主要表現為牛纖維素性化膿性肺炎，莢膜B型主要表現為牛出血性敗血癥。由于Pm可以在同種或不同種動物間互相傳染，對養殖業危害嚴重。

多殺性巴氏桿菌病的病原學診斷方法主要有細菌的分離培養、生化鑒定、動物回歸試驗等，這些方法費時、操作繁瑣、準確率低，不適合臨床快速診斷的需要。近年來PCR方法已經大量應用在巴氏桿菌病的診斷中，根據多殺性巴氏桿菌保守基因設計引物，可以診斷莢膜A、B、D、E和F 5個血清型。但由于PCR方法需要特殊的儀器設備和專業的技術人員，在基層條件差和技術人員匱乏的情況下，現場實地快速診斷很難實現。此外，現有的采用PCR診斷多殺性巴氏桿菌的報道中，其設計引物所依據的保守基因序列有多種，有的以多殺性巴氏桿菌毒素基因(toxA)作為保守序列設計引物(CN104073567A)；有的以多殺性巴氏桿菌的的PlpB基因作為靶基因設計引物(“豬多殺性巴氏桿菌環介導等溫擴增檢測方法的建立”，中國預防獸醫學報，2014年12月)，而根據不同的靶標(保守基因)設計的引物序列不同，對巴氏桿菌的診斷和檢測效果也存在較大差異，因此，選擇何種靶標作為引物設計的依據也是PCR診斷多殺性巴氏桿菌的難點之一。

LAMP技術雖然可以進行核酸的恒等溫擴增，但由于它的反應溫度在60℃-65℃，反應時間在30-60min，仍然不能在常溫下進行，并且不能對核酸粗提物的DNA樣本進行直接擴增。因此，從診斷的時效性方面考慮，亟需一種可用于現場恒等溫條件下的簡易核酸檢測技術。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術是目前新出現的一種體外快速核酸擴增技術，在37℃左右就能發生反應，并且僅需十幾分鐘就能擴增出痕量級的檢測產物。同時RPA可以完成核酸粗提物的擴增，它可以通過瓊脂糖凝膠電泳，熒光擴增曲線和側流層析試紙條(Lateral Flow Dipstick，LFD)三種方式檢測結果，這三種方式的引物與探針反應原理是不同的。基本的RPA擴增只需上下游引物，產物通過凝膠電泳檢測，而RPA-nfo和RPA-exo反應，是通過不同的探針結合到模板互補鏈后再通過核酸內切酶IV(nfo)和核酸內切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，這兩種方法分別通過LFD(nfo)和實時熒光(exo)兩種不同的手段檢測結果。凝膠電泳和熒光擴增曲線法仍然依賴實驗室和特殊儀器設備，而LFD是一種無需特殊儀器可用于現場的檢測方法。將RPA技術與LFD技術結合，通過LFD讀取結果，既不要求特殊儀器設備，也無需復雜的樣品處理，借助恒溫水浴鍋用LFD就可以通過肉眼觀察結果。

但RPA技術屬于新興的核酸擴增技術，其應用并不十分普遍，其主要技術難點在于特異性引物和探針的設計和篩選，而引物/探針的設計和選擇對RPA-nfo的結果是至關重要的，目前并沒有像PCR擴增技術那樣專門的引物/探針的設計軟件，也沒有較多的文獻和試驗數據提供技術依據。經相關檢索，目前還未有針對多殺性巴氏桿菌進行RPA-LFD檢測的相關報道。

綜上，對于多殺性巴氏桿菌的RPA-LFD檢測，目前尚無明確可借鑒的思路和結果，還需要技術人員做大量和深入的研究。

發明內容

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種用于現場快速檢測多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種用于現場快速檢測多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針；其RPA-nfo正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，其RPA-nfo探針序列如SEQ ID NO.3所示。

具體序列如下：