[發明專利]用于現場快速檢測多殺性巴氏桿菌的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201710178429.3
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN106811541A
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 何洪彬;趙貴民;侯佩莉;王洪梅;何成強
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 王志坤

1.一種用于現場快速檢測多殺性巴氏桿菌的引物和探針組合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針的序列如下所示：

正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；

反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；

探針：5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'。

2.權利要求1所述的引物和探針組合在制備多殺性巴氏桿菌檢測的試劑盒、芯片和/或擴增反應試劑中的用途。

3.一種檢測多殺性巴氏桿菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含權利要求1所述的引物和探針組合。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒中還包括有：陽性質控標準品、陰性質控標準品和RPA-nfo反應液。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性質控標準品為包含多殺性巴氏桿菌Kmt1基因片段陽性質控標準品；

優選的，所述的包含多殺性巴氏桿菌Kmt1基因片段陽性質控標準品，由含有192個堿基的核苷酸片段構成的pEASY-T3重組質粒組成；

所述含有192個堿基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No.4所示。

6.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性質控標準品為pEASY-T3空載質粒。

7.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述RPA-nfo反應液，包括下述試劑中的至少一種：

recA重組酶、鏈置換DNA聚合酶、單鏈DNA結合蛋白、rehydration緩沖液、280mM醋酸鎂溶液、側流層析試紙條、LFD檢測緩沖液、滅菌去離子雙蒸水，TE緩沖液、SDS、蛋白酶K和多殺性巴氏桿菌標準陽性模板。

8.一種非診斷目的的檢測多殺性巴氏桿菌的方法，其特征在于，步驟如下：

(1)檢測樣本DNA的提取或檢測樣本的現場裂解處理；

(2)以步驟(1)中處理的樣本為模板，利用權利要求1所述的引物和探針組合進行RPA-nfo擴增；

(3)用LFD檢測上述RPA-nfo擴增產物，根據檢測結果判定樣本中是否含有多殺性巴氏桿菌。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述RPA-nfo擴增體系為25μL：其中包括1.0μL的正向引物，1.0μL的反向引物，0.3μL的探針，rehydration緩沖液14.75μL，待測樣本DNA或粗裂解產物2μL，ddH₂O 4.7μL；將上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反應管，充分混勻、溶解，最后加入280mM的醋酸鎂溶液1.25μL，上下顛倒混勻后直接在37℃恒溫水浴鍋處理25min。

10.如權利要求8所述的方法，其特征在于：步驟(3)的具體步驟為：取1μL RPA擴增產物與49μL的LFD檢測緩沖液混合，將LFD置入上述混合液中，5min內觀察結果，若同時出現檢測條帶和對照條帶，則該樣品多殺性巴氏桿菌核酸陽性，僅出現對照條帶則說明該樣品中不含多殺性巴氏桿菌，如果僅出現檢測條帶或者無條帶則說明RPA-LFD檢測不成立。