[發(fā)明專利]一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法

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• 申請日: 2017-03-22
• 公開（公告）號: CN106755555A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設計）人: 車樹剛;馬韻升;劉圣鵬;馬娜娜;張心青;冉新新;郭南南;李琦;任曉燕;張蕭蕭
• 申請（專利權）人: 黃河三角洲京博化工研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司37205
• 代理人: 趙斌,苗峻

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程技術領域，提供了一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法。

背景技術

近年來，我國環(huán)境污染日益嚴重，成為當前人類面臨的一個重大問題。特別是工業(yè)及生活污水中的氨氮污染，可以引起水體富營養(yǎng)化和水體生態(tài)系統(tǒng)紊亂等一系列問題。生物硝化脫氮是目前水處理領域研究的熱點，由硝化作用和反硝化作用共同完成，其中硝化作用分為兩個階段，首先由亞硝化細菌把氨氮氧化為亞硝酸鹽氮，然后由硝化細菌把亞硝酸鹽氮氧化為硝酸鹽氮。但是目前已運行的生物硝化脫氮池達標率不高，解決問題的關鍵在于提高池內亞硝化細菌和硝化細菌的生物量及其活性，這就需要一個快速檢測亞硝化細菌和硝化細菌的方法，用以指導生物硝化池的運行。

通常所用的亞硝化細菌鑒定方法一般為16S rDNA擴增法，早在很久之前該方法就普遍用于細菌菌種的鑒定。該法以細菌16S rDNA區(qū)域通用引物作為擴增引物，PCR擴增結束后要把PCR產物測序、比對后才只能將菌種鑒定到屬，這樣用通用引物進行的PCR擴增結果特異性不高，而且還延長了菌種鑒定的周期，達不到快速檢測的目的。

因此找尋針對亞硝化細菌PCR鑒定方法的最佳PCR條件成為本領域技術人員難以解決的問題。

發(fā)明內容

本發(fā)明針對上述技術存在的不足，提供了一種亞硝化細菌的PCR鑒定方法，以亞硝化細菌的專屬特征性基因-氨單加氧酶基因(amoA)為模板設計合成一對特異性引物，并以亞硝化細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，通過對PCR擴增條件優(yōu)化，然后對PCR擴增產物進行瓊脂糖水平電泳，根據(jù)電泳泳道中條帶的有無及大小，判斷該細菌菌株是否屬于亞硝化細菌或者混合菌群中是否含有亞硝化細菌。本方法是以用氨單加氧酶基因為模板設計的特異引物為PCR擴增引物，實驗結果特異性強，實驗操作簡單，結果可靠性高，并通過優(yōu)化PCR擴增條件縮短了亞硝化細菌的鑒定周期，較常規(guī)PCR擴增時間縮短26％以上，為亞硝化細菌種群的鑒定提供了一個快速、有效的鑒定方法。

現(xiàn)有技術中PCR擴增在PCR儀內完成，而擴增條件基本一致，這已成為了本領域的基本常規(guī)操作，但是發(fā)明人發(fā)現(xiàn)針對本發(fā)明的目的，常規(guī)的PCR擴增條件難以適應，存在準確率較低且擴增時間較長的缺陷，難以適應本發(fā)明的要求，故此發(fā)明人針對這一缺陷對PCR擴增條件進行了改進。

本發(fā)明的具體技術方案如下：

⑴引物的設計與合成：以亞硝化細菌的專屬特征性基因氨單加氧酶基因(amoA)為模板，根據(jù)引物設計原則，利用primer 5.0軟件設計并合成一對特異性引物，引物具體序列如下：

上游引物(F)：5'-GGGGTTTCTACTCCTGGT-3'，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示；

下游引物(R)：5'-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC-3'，其核苷酸序列如Seq ID No:2示；

⑵菌種基因組DNA的提取：采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測菌種的基因組DNA；

⑶PCR擴增體系：分別以步驟(1)中合成的特異引物為PCR擴增引物，以步驟(2)中提取的基因組DNA為PCR擴增模板，進行PCR擴增。PCR擴增體系(25ul)如下：