[發明專利]一種用于檢測樟疫霉菌的引物及巢式PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201710177242.1
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN106868164B
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 蘭成忠;姚錦愛;阮宏椿;吳瑋
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;陳彩芳

本發明提供了一種用于檢測樟疫霉菌（Phytophthora cinnamomi）的引物及巢式PCR檢測方法，所述引物組包括2對引物，第1對為疫霉菌Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R，第2對為鑒定樟疫霉菌的特異性引物PCINF/PCINR。本發明只要有10fg/μL病原菌微量DNA存在，即可準確檢測出，本發明所提供的樟疫霉菌巢式PCR檢測方法具準確性高、特異性強、靈敏度高、檢測過程操作簡便快速等優點，可用于樟疫霉菌引起病害的早期診斷和病菌的監測和鑒定，克服了傳統檢測和鑒定方法步驟繁瑣、周期長等問題。

技術領域

本發明提供了一種用于檢測樟疫霉菌的引物，同時還提供了利用該引物組進行巢式PCR擴增檢測的方法，屬于作物病害檢測、鑒定及防治技術領域。

背景技術

樟疫霉菌(Phytophthora cinnamomi) 屬于卵菌門(Oomycota)、卵菌綱(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉屬(Phytophthora)，是植物重要病原菌，廣泛分布于歐洲、美洲、東南亞及大洋洲等地區，其寄主廣泛，包括樟屬植物在內的超過3000多種花卉、林木和農業作物等。樟疫霉主要侵染植物根部，阻斷水分和養分的運輸，從而導致宿主植株致病，其所致植物病害的常見癥狀包括葉枯黃且易脫落、樹干潰瘍并伴有膠狀物滲出、莖潰瘍（可致植物猝死）、果腐、心腐及其他營養器官腐爛、幼苗及果實生長緩慢，產量銳減等，嚴重時可導致全株死亡等，樟疫霉已成為農、林業中植物病害防治的重要病原菌之一。據報道，樟疫霉菌已經造成澳大利亞西南地區森林發生結構和植物種群變化，已經嚴重威脅到當地自然生態系統以及生物多樣性；樟疫霉菌引起的鱷梨疫病，是世界各地分布最廣泛的病害之一，對鱷梨生產造成了嚴重影響，在美國加利福尼亞州，近60%-75%的鱷梨種植園被樟疫霉侵染，平均每年經濟損失超過4000多萬美元，占年總產值的30%。樟疫霉在我國東南沿海地區（包括上海、江蘇、浙江、福建和臺灣）及云南、北京等地有一定分布，嚴重引起鱷梨、刺槐、雪松及山茶花、杜鵑花等各種名貴植物的發病與死亡。近年來隨著農業結構的調整，蔬菜、果樹、花卉、中草藥以及設施農業大力發展，樟疫霉對農業的威脅日趨嚴重。樟疫霉是一種土傳病原菌，它以不同形態腐生、寄生或專性寄生于土壤及植物組織，通過地表和地下水流動、植物根系相互接觸、動物移動及人類活動（修路、伐木、采礦等）傳播，一般情況下，植株受樟疫霉侵染后可繼續存活數年，特別是在氣溫較低且潮濕的環境下，但有時樟疫霉侵染可導致植株突然死亡。由于樟疫霉侵染多數發生在植物根部，經常被人們忽視，等有明顯的地上部分癥狀出現時，樟疫霉侵染植株有可能已有數月甚至數年。目前對樟疫霉菌病害還沒有有效的防治措施，因此，防止和控制樟疫霉病原體的傳播將是很好的控制方法。強勁、快速、可靠的檢測是及時實施遏制措施，防止或限制樟疫霉傳播，避免造成嚴重經濟和社會后果的首要條件。

樟疫霉菌傳統的分類鑒定主要是基于形態學特征(菌落形態、菌絲形態、厚垣孢子的有無、孢子囊特征、孢囊梗層出方式、孢子囊的脫落性及雄器的類型等)、致病性測定、生理生化特征等。在進行形態學鑒定時需對樟疫霉進行分離，然而同一選擇性培養基上，其他生長速度較快的微生物會抑制樟疫霉生長，造成分離存在一定的困難。另外，疫霉屬種間的形態學性狀常出現重疊現象，樟疫霉種內各菌株形態學性狀存在差異，而且易受環境條件影響（宿主、培養基、溫度等）而出現不穩定性狀。雖然傳統方法在樟疫霉菌檢測中發揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業的疫霉菌分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗；同時傳統分類鑒定方法耗時長、靈敏度低、易受人為及環境等諸多因素的干擾，不能在病害潛伏期和發病初期做出診斷，很難對病害發生進行及時的監測和有效控制。