[發明專利]一種用于檢測樟疫霉菌的引物及巢式PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201710177242.1
• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN106868164B
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 蘭成忠;姚錦愛;阮宏椿;吳瑋
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊;陳彩芳

1.一種用于檢測樟疫霉菌的引物，其特征在于，所述引物為鑒定樟疫霉菌的特異性引物PCINF/PCINR和通用引物ph1F/Yph2R，所述引物PCINF/PCINR序列如下：

PCINF：5'- CGCTAACGTCGTTGTTGTTT -3'，

PCINR：5'- CCTATAATATCGGACGTACCTATCG -3'；

所述引物ph1F/Yph2R的序列如下：

ph1F：5'-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3'，

Yph2R：5'-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3'。

2.一種使用權利要求1所述引物進行巢式PCR檢測樟疫霉菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：：

（1）提取待測樣品基因組DNA，低溫保存備用；

（2）巢式PCR第1輪擴增：以步驟（1）提取的DNA為模板，利用Ypt1基因通用引物ph1F/Yph2R進行第1輪擴增，所述巢式PCR第1輪擴增反應體系和反應程序如下：

PCR反應體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，10 μmol/L的ph1F /Yph2R引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，用無菌超純水補足至25 μL；

擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性1 min、58℃退火30 S、72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸10 min；

（3）巢式PCR第2輪擴增，待步驟（2）第一輪PCR擴增結束后，取1.0μl 第一輪PCR擴增產物或擴增產物的稀釋液為模板與樟疫霉菌特異性引物PCINF/PCINR組合進行第2輪PCR擴增，所述巢式PCR第2輪擴增反應體系和反應程序如下：

PCR反應體系25 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，10 μmol/L的PCINF/PCINR引物各1.0μL，第1輪PCR擴增產物或稀釋液作為DNA模板1.0μL，用無菌超純水補足至25 μL；

擴增反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性1 min、59℃退火30 S、72℃延伸1 min，35個循環，最后72℃延伸10 min；

（4）凝膠電泳檢測：取5.0μL步驟（3）第2輪PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，電壓為4-5V/cm，電泳40 min后經溴化乙錠染色于紫外燈下觀察，根據擴增產物的有無及其片段大小對結果進行判斷，如果能特異性地擴增出320bp的產物，即可判斷所述的檢測樣品中存在樟疫霉菌，否則未檢出。

3.如權利要求1所述的引物在樟疫霉菌引起病害的早期診斷和病菌的監測、鑒定上的應用。