[發(fā)明專利]稀有基因突變的檢測

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• 申請日: 2017-03-23
• 公開（公告）號: CN108624662A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發(fā)明（設計）人: 陳漢奎;劉和錄;覃海德
• 申請（專利權）人: 陳漢奎
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京市正見永申律師事務所 11497
• 代理人: 閔丹;黃小臨

本文涉及稀有基因突變的檢測方法，其利用高選擇性基因突變檢測引物和阻物，通過特異性抑制野生型擴增，達到富集稀有突變產物的目的。本文所述方法、引物和阻物特別適用于NGS技術對cfDNA中的稀有基因突變進行高效低成本的檢測。

技術領域

本文涉及基因突變的檢測，尤其涉及選擇性富集稀有基因突變的方法，相應的富集體系，該富集體系中的引物和阻物。

背景技術

基因突變是指基因組DNA分子發(fā)生的堿基序列的變異現(xiàn)象。從分子水平上看，基因突變是指基因在結構上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變。基因突變的研究已成為當今生命科學研究的熱點之一，檢測方法也隨之迅速發(fā)展，尤其是第二代測序技術(NextGeneration Sequencing,NGS)的建立，使基因突變檢測進入了一個高通量的新時期。但是在野生型模板的較高背景下，不管是傳統(tǒng)的qPCR檢測技術還是NGS技術，針對較低含量的基因突變的檢測能力都有限。

稀有基因突變，是指存在于大量野生基因序列背景中的極為稀少的基因突變。稀有基因突變最為常見的例子就是發(fā)生在腫瘤細胞中的低頻基因變異，許多引起腫瘤的體細胞突變都是摻雜在野生型細胞內的，所得到的DNA樣本中會帶有大量野生型DNA，基因突變的含量常常都在10％以下或者更低。在臨床中，癌癥初期病人和治療前后的腫瘤病人，病人血液中會含有少量的腫瘤突變DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，并且ctDNA的含量隨腫瘤負荷和治療反應而發(fā)生變化，通常都在1％以下或甚至更低。這些ctDNA攜帶了與腫瘤細胞中一樣的基因突變信息，同樣可以用于腫瘤的早期檢測、靶向用藥和預后檢測。另外，ctDNA是無創(chuàng)取樣，從突變信息上說更能反映腫瘤基因突變的全貌，因此，以ctDNA為檢測對象的液體活檢技術具有其優(yōu)越性，應用也越來越受到重視。

目前稀有突變檢測方法中，主要有作為“金標準”的Sanger基因測序。但是Sanger測序的靈敏度有限，在大量野生型基因的背景下，Sanger測序僅能檢測到含有5％的突變，所以不適于對ctDNA的檢測。目前，定量qPCR也是常用的稀有突變檢測方法，可以用于腫瘤細胞基因突變檢測，對ctDNA基因突變的檢測，也顯示一定的能力。但是，這些qPCR技術存在通量小，單個成本高，分辨能力有限，樣本消耗量大的缺點，不利于廣泛應用。

靶向NGS技術是目前最為大家認可的用于檢測ctDNA的技術。由于ctDNA含量很低，靶向NGS需要選擇性設計檢測位點組合(panel)，通過采用探針捕獲或者Ampliseq擴增技術來對待測區(qū)域進行富集和建庫，以提高數(shù)據(jù)有效率。但是，對低頻的突變，這些富集方法并不能提高檢測的靈敏性，只能依靠加深測序深度(對相同模板的讀取次數(shù))才能完成對稀有突變的檢測。例如，對含量為0.1％的突變，就需要10000x以上的測序深度才能檢測出來。因測序芯片容量和成本限制，對低于0.1％的突變，NGS就面臨挑戰(zhàn)。如何在保證待測區(qū)域得到富集的前提下，進一步提高稀有突變的比率以降低對測序深度的依賴，就成為提高NGS靈敏性和降低測序成本的關鍵。

發(fā)明內容

本文提供一種聚合酶鏈式反應(PCR)方法，其可以用于對稀有基因突變進行檢測，所述稀有基因突變例如是突變頻率為0.1％或更低的目標基因突變。根據(jù)本文所述方法，在第一輪擴增中對所有包含突變所在位點的模板進行擴增，不區(qū)分其序列是野生型還是突變型；在第二輪擴增中通過抑制野生型擴增，來選擇性擴增突變型序列。這樣一來，可以達到富集稀有突變產物的目的。因此，用本文的方法可以實現(xiàn)NGS對ctDNA等樣本中稀有突變的高效、低成本檢測。

在一個具體實施方案中，本文所述的PCR方法，在第一輪擴增中依次包括變性、引物退火、和延伸的步驟，但不含有阻物；在第二輪擴增中依次包括變性、阻物退火、引物退火、和延伸的步驟。