[發明專利]一種鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體的微衛星標記與特異性引物及應用

有效

• 申請號: 201710174183.2
• 申請日: 2017-03-22
• 公開（公告）號: CN106811540B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 朱傳坤;潘正軍;王輝;常國亮;丁懷宇;聶孝燕;余祥勝;吳楠
• 申請（專利權）人: 淮陰師范學院
• 主分類號: C12Q1/6879
• 分類號: C12Q1/6879;C12N15/11
• 代理公司: 淮安市科文知識產權事務所 32223
• 代理人: 謝觀素

1.一種鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體的微衛星標記，其特征在于：該微衛星標記的核苷酸序列為SEQ ID NO:1-2中的任一個。

2.一種特異性擴增如SEQ ID NO:1-2中任一所示微衛星標記序列的引物對。

3.根據權利要求2所述的引物對，其特征在于：所述引物對上下游引物的序列如SEQ IDNO:3-4所示。

4.一種用于烏蘇里擬鲿雌、雄個體鑒定的試劑盒，其特征在于：該試劑盒包含權利要求2或3所述的引物對。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還可以包括PCR技術常用的試劑。

6.權利要求1所述的微衛星標記、權利要求2或3所述的引物對、權利要求4或5所述的試劑盒在烏蘇里擬鲿雌、雄個體鑒定中的應用。

7.一種鑒定烏蘇里擬鲿雌、雄個體的方法，其特征在于：包括如下步驟：

1）基因組總DNA抽提：抽提目標個體的基因組DNA；

2）微衛星標記PCR 擴增：采用權利要求3所述的引物對，以步驟1）獲得的目標個體基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得目標個體微衛星PCR擴增產物；

3）擴增產物電泳檢測：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳及GoldView染色法檢測步驟2）獲得的微衛星PCR擴增產物；

4）基因型分析：根據每個個體微衛星PCR擴增產物的分子量大小確定基因型，若某一個體在該微衛星標記表現為雌性等位基因型，則該個體為雌性；若某一個體在該位點表現為雄性等位基因型，則該個體為雄性。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟4）中，若某一個體只在130 bp處有擴增條帶，則該個體為雌性；若某一個體在130 bp和118 bp處均有擴增條帶，則該個體為雄性。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR擴增的反應體系：以總體積13 μL為例，包含30-50 ng的模板DNA，0 .5 U Taq DNA聚合酶，1 .3 μL 10× PCR Buffer，0 .5μL 2.5 mM dNTP，0.5 μL正反向混合引物，正反向混合引物各2.5 μM，9.6 μL滅菌超純水；所述PCR擴增的程序為：95°C預變性5分鐘；以94°C變性40秒、54°C退火40秒、72°C延伸40秒為一個循環，共循環36個；最后72°C終延伸7分鐘，PCR產物于4°C保存。

10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟3）的詳細過程為：將微衛星PCR擴增產物在10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，30 W 恒功率電泳2小時10分鐘進行分離；將膠板通過1 .5%的GoldView溶液顯色5-8分鐘，即可得到目標個體在該微衛星座位的基因分型。