[發明專利]一株減毒高產鼠李糖脂的工程菌株及其構建與應用

在審

• 申請號: 201710172680.9
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106754609A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 張友明;尹佳;符軍;姜嬋娟
• 申請（專利權）人: 山東大學蘇州研究院;山東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12P19/44;C12R1/385
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株減毒高產鼠李糖脂的工程菌株及其構建與應用。

背景技術

鼠李糖脂是由假單胞菌或伯克氏菌類產生的一種生物表面活性劑，也是研究時間最長、應用技術最為成熟的一種生物表面活性劑。它在土壤、水體和植物中都自然存在，屬于一種糖脂類的陰離子表面活性劑，不僅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在堿性水溶液中也表現出良好的溶解特性。它兼具良好的化學和生物特性，具有油、水兩親性，可以降低水表面張力，可以作為潤濕劑、乳化劑和發泡劑使用，無毒、能生物降解，在溫度、PH值及鹽度處于極端狀況下也可使用。

目前，工業上主要采用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)發酵法生產鼠李糖脂，而銅綠假單胞菌被認為是三種最強人類條件致病菌之一，故限制了其在工業生產中的廣泛應用。基于此，人們期望選擇利用相對安全的工業微生物進行鼠李糖脂的生產，以降低其在生產中的潛在危害，拓展相關產品的應用范圍。已報到的有利用伯克氏菌Burkholderia、綠針假單胞菌Pseudomonas chlororaphis等非條件致病菌生產鼠李糖脂，但由于這些微生物遺傳背景相對不清晰且缺乏簡便的遺傳操技術，很難進一步提高鼠李糖脂的產量，無法滿足生產要求。人們也嘗試選擇非致病微生物如大腸桿菌通過異源表達來生產鼠李糖脂，而大腸桿菌作為一種“一般認為安全(GRAS)”的模式生物，雖具有清晰的遺傳背景、成熟的遺傳操作技術及廣泛的工業應用，是異源合成鼠李糖脂合適的選擇，但是其產量卻遠遠達不到工業生產的要求。經過文獻檢索，有關通過敲除銅綠假單胞菌的芳香族氨基酸合成相關基因5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA實現減毒，且將該減毒菌鼠李糖脂合成相關基因自轉運酯酶基因EstA和鼠李糖基轉移酶復合物基因RhlAB構建到一個以pBBRI為復制子的多拷貝質粒上，增加鼠李糖脂合成相關基因的拷貝數，實現增加鼠李糖脂產量的文獻或專利還未見報道。

發明內容

針對目前鼠李糖脂工業化生產菌株的高毒性或者低產量，本發明的目的是提供一株減毒高產鼠李糖脂的工程菌株——重組綠膿桿菌工程菌及其構建與應用。

本發明所述減毒高產鼠李糖脂的重組綠膿桿菌工程菌，其特征在于：該工程菌是其基因組中已敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)且含有過表達質粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta的銅綠假單胞菌(Pseudomas aeruginosa)，命名為PAO1aroA；其中，所述過表達質粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發明所述減毒高產鼠李糖脂的重組綠膿桿菌工程菌的構建方法，步驟是：

利用假單胞菌噬菌體的重組酶構建的同源重組系統，將一段50bp-100bp的攜帶短同源臂的抗性基因DNA片段整合到銅綠假單胞菌(Pseudomas aeruginosa)的染色體上，實現敲除芳香族氨基酸合成的基因aroA(5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)，獲得減毒銅綠假單胞菌，再構建包含鼠李糖脂合成的轉運酯酶基因EstA和鼠李糖基轉移酶復合物基因RhlAB，慶大霉素抗性基因，接合轉移起始位點oriT和一個廣譜型復制子pBBRI的過表達質粒pBBR1-oriT-rhlAB-estA-genta，并將該過表達質粒轉入獲得的減毒銅綠假單胞菌中，即得到通過多拷貝質粒增加該菌鼠李糖脂合成相關基因的拷貝數實現的減毒高產鼠李糖脂的重組綠膿桿菌工程菌。

本發明所述減毒高產鼠李糖脂的重組綠膿桿菌工程菌在工業化生產鼠李糖脂中的應用。

本發明構建的鼠李糖脂減毒高產的銅綠假單胞菌菌株，它不僅可以提高鼠李糖脂產量，而且毒性減低。實驗證實：通過敲除銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomas aeruginosa PAO1)的芳香族氨基酸合成相關基因5-烯醇丙酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA后，突變株毒性檢測證明該菌已減毒。同時，本發明將該減毒菌鼠李糖脂合成相關基因自轉運酯酶基因EstA和鼠李糖基轉移酶復合物基因RhlAB構建到一個以pBBRI為復制子的多拷貝質粒上，從而增加鼠李糖脂合成相關基因的拷貝數，最終達到增加鼠李糖脂產量的目的。這種方法也適用于其它細菌次生代謝產量的提高，具有非常重要的應用價值。

本發明構建的鼠李糖脂減毒高產的銅綠假單胞菌菌株可以直接應用于工業化生產鼠李糖脂，其產量完全可以達到工業生產的要求，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1.高效同源重組系統介導的aroA基因敲除。