[發明專利]番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR及其克隆方法與應用方法

有效

• 申請號: 201710172194.7
• 申請日: 2017-03-22
• 公開（公告）號: CN106916825B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 欒雨時;姜寧;崔軍;楊廣磊
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

本發明提供了一種番茄抗晚疫病基因SpNBS?LRR，其DNA分子序列如SEQ ID NO.1所示；提供了該基因的克隆方法，以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA為模板進行PCR擴增；將得到的PCR產物與pMD?19T克隆載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進行測序；還提供了該基因的應用方法，培育抗晚疫病番茄植株。本發明方法得到的過表達植株中SpNBS?LRR的表達量高于野生型植株，其抗晚疫病效果更優。本發明通過過表達SpNBS?LRR基因使番茄對晚疫病的抗性增強，對培育抗晚疫病番茄品種具有重要意義。

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一個番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的克隆及應用。

背景技術

番茄是一種世界范圍內廣泛種植的經濟、園藝作物。在其生長過程中，由各種病原物引起的植物病害，嚴重影響了番茄的產量，造成了巨大的經濟損失。近年來，晚疫病成為最嚴重的番茄病害之一，對農業生產及經濟發展造成了重大損失。雖然化學農藥對晚疫病的發生和蔓延有一定的控制作用，但由此引發的環境污染，病原菌抗藥性等問題，依舊給農業生產帶來了極大的困擾，因此，研究番茄抗病的分子機制，用生物學方法提高番茄對晚疫病的抗性成為了關鍵問題。

在自然界中，包括番茄在內的植物經常遭受各種病原菌的入侵，嚴重影響它們的生長發育。為了抵御這些病原菌，植物進化出了一系列的免疫機制。當病原菌入侵植物時，其保守分子被植物的胞外跨膜受體所識別，激活病原物相關分子模式觸發免疫(PTI)。盡管PTI成功抵御了大部分病原菌的入侵，少數病原菌進化出了相應的效應因子來突破PTI防線。植物中抗性基因(R基因)所編碼的抗性蛋白(R蛋白)可以識別這些效應因子，從而激活高效的免疫反應，效應子觸發免疫(ETI)。

NBS-LRR基因是植物基因組中一類高度保守且豐富的R基因。其編碼的NBS-LRR蛋白可以識別病原物的效應因子Avr蛋白進而引起過敏反應(HR)。HR反應可以導致初始侵染部位的植物細胞程序性死亡抑制病原菌的生長。目前，研究者們已經從多種植物中克隆得到了大量NBS-LRR基因并對其在植物免疫中的功能進行了探究。如從抗性辣椒品系HDA149中得到的CaRKNR基因，對其進行沉默后辣椒對于線蟲的抗性明顯下降。小麥Pm3b基因可為其提供白粉病的小種特異抗性。在水稻中，Pi64可以提高其對稻瘟病菌的抵抗能力，另一個基因OsRP1L1可以提高其對于白葉枯病的抗性。同時絲瓜中的NBS-LRR基因與葉卷曲和花葉病抗性有關。

發明內容

本發明的目的在于一種克隆番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的方法，并提供該基因在番茄抗晚疫病中的應用方法。

為了達到上述目的，本發明提供了一個番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明還提供了上述番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的克隆方法，以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA為模板，以SpNBS-LRR-FP、SpNBS-LRR-RP為特異性引物，進行PCR擴增；所述特異性引物的序列分別如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

克隆所用特異性引物具體為如下：

SpNBS-LRR-FP：CGGGATCCATGTGTGTGGGAAGAGTTACAGATT，

SpNBS-LRR-RP：CGAGCTCTTACTCTAGTCTTTCAAGTTTGGGG；

將得到的PCR產物與pMD-19T克隆載體連接，得到的連接產物轉化大腸桿菌DH5α并涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，挑取單菌落進行測序。測序結果如SEQ ID NO.1所示。

本發明還提供了番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的應用方法，用于培育抗晚疫病番茄植株。

具體通過以下技術方案實現：