[發明專利]番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR及其克隆方法與應用方法

有效

• 申請號: 201710172194.7
• 申請日: 2017-03-22
• 公開（公告）號: CN106916825B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 欒雨時;姜寧;崔軍;楊廣磊
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 大連格智知識產權代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

1.一種番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的應用方法，其特征在于，用于培育抗晚疫病番茄植株。

2.權利要求1所述番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的應用方法，其特征在于，通過以下技術方案實現：

將含有番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的重組表達載體轉化農桿菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、鏈霉素及利福平的YEB固體培養基上，挑取單菌落進行菌液PCR驗證；

選取陽性工程菌侵染預培養后的番茄子葉，共培養，分化出芽；

將抗性芽移至生根培養基中誘導生根后移栽，實時定量PCR驗證過表達植株；

對過表達SpNBS-LRR的番茄苗進行抗病性檢測，得到抗晚疫病番茄植株。

3.根據權利要求2所述番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的應用方法，其特征在于，所述重組表達載體由將所述番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR插入表達載體得到。

4.根據權利要求3所述番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的應用方法，其特征在于，所述重組表達載體的具體制備方法為：

以野生型抗晚疫病番茄L3708的cDNA為模板，以SpNBS-LRR-FP、SpNBS-LRR-RP為特異性引物，進行PCR擴增；

所述特異性引物的序列分別如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；

將得到的PCR產物與pMD-19T克隆載體連接，得到的連接產物轉化大腸桿菌DH5α并涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，挑取單菌落進行測序；

提取上述連接番茄抗晚疫病基因SpNBS-LRR的單菌落的質粒，并用限制性內切酶BamHI及SacI雙酶切，回收得到目的片段，將所述目的片段與去除GUS基因的pBI121表達載體連接，得到的連接產物即為重組表達載體。