[發(fā)明專利]一種DNA分子STTM?miR482a及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710172193.2
• 申請日: 2017-03-22
• 公開（公告）號: CN106754932A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 欒雨時;楊廣磊;崔軍;姜寧;肖裕
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 大連格智知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司21238
• 代理人: 劉琦

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種STTM-miR482a及其在抑制植株microRNA482a功能中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

MicroRNA(miRNA)是一類長約22nt的內(nèi)源RNA，是生物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子之一，參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育以及脅迫響應(yīng)等過程。成熟的miRNA與AGO1蛋白等組成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體對靶基因進(jìn)行切割或抑制其翻譯，從而發(fā)揮調(diào)控作用。最近，有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中IPS1基因與miR399之間可以通過堿基互補(bǔ)配對方式結(jié)合，IPS1基因在切割位點處形成了3個堿基的錯配環(huán)，該錯配環(huán)使miR399不能對IPS1基因進(jìn)行切割，同時也避免IPS1基因被降解。當(dāng)IPS1過表達(dá)時，其與miR399結(jié)合，從而導(dǎo)致miR399不能與其靶基因結(jié)合，使miR399失去了原有的調(diào)控作用，IPS1被稱為內(nèi)源的靶基因模擬物。后來研究者用人工設(shè)計的48nt的接頭將兩個內(nèi)源的靶基因模擬物片段連接在一起形成短串聯(lián)靶模擬(Short Tandem Target Mimic-STTM)。STTM可以作為沉默miRNA的工具，應(yīng)用于miRNA的相關(guān)研究。自從miR482在毛果楊中第一次被發(fā)現(xiàn)以來，人們已在多種植物中如擬南芥、煙草、番茄發(fā)現(xiàn)了miR482。在未受病原菌侵染時，植物會利用miR482沉默體內(nèi)大部分的NBS-LRR基因。NBS-LRR基因是一個植物體內(nèi)抗病基因的大家族，當(dāng)病原物侵染植物時，NBS-LRR識別病原體分泌的效應(yīng)蛋白，引起植物的超敏反應(yīng)，進(jìn)一步抑制病原物的擴(kuò)散。抑制番茄中miR482的表達(dá)，可以有效的解除miR482對NBS-LRR基因的沉默作用，提高植物的抗病性。在現(xiàn)有的技術(shù)中，利用STTM技術(shù)提高植物抗病性的方法還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種DNA分子STTM-miR482a，并將其應(yīng)用于調(diào)控microRNA482a功能。

上述目的為達(dá)到，本發(fā)明提供了一種DNA分子STTM-miR482a，其核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了上述DNA分子STTM-miR482a的應(yīng)用，具體為將表達(dá)DNA分子STTM-miR482a的重組載體用于調(diào)控植物中microRNA482a表達(dá)、調(diào)控植物抗病性，尤其適用于提高植物的抗晚疫病性；

所述microRNA482a的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

所述調(diào)控的具體方法為：將所述表達(dá)DNA分子STTM-miR482a的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、鏈霉素及利福平的YEB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR驗證。選取陽性工程菌侵染預(yù)培養(yǎng)后的番茄子葉，共培養(yǎng)，分化出芽，將抗性芽移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根后移栽，實時定量PCR驗證即得到可調(diào)控microRNA482a表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。

含有本發(fā)明STTM-miR482a DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物的抗病性高于其他目的植物。

優(yōu)選方式下，所述目的植物為雙子葉植物番茄。

上述重組表達(dá)載體優(yōu)選含有DNA分子STTM-miR482a的載體。

上述應(yīng)用中，將DNA分子分子STTM-miR482a插入表達(dá)載體中，即得到表達(dá)STTM-miR482a的重組表達(dá)載體。

優(yōu)選方式下，所述表達(dá)載體為PBI121載體；上述表達(dá)STTM-miR482a的重組表達(dá)載體的具體制備方法為：將所述DNA分子STTM-miR482a插入PBI121載體的SacⅠ和Bam HⅠ之間，且插入的位置為CaMV35s啟動子之后，即得到表達(dá)STTM-miR482a的重組表達(dá)載體，本發(fā)明將該重組表達(dá)載體命名為PBI-STTM-miR482a。

本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新在于：

1、本發(fā)明獲得了過表達(dá)STTM-miR482a的轉(zhuǎn)基因番茄植株。

2、本發(fā)明DNA分子通過抑制野生型番茄中microRNA482a的表達(dá)得到轉(zhuǎn)基因番茄，與野生型番茄相比，對晚疫病的抗性增強(qiáng)。

3、本發(fā)明對培育抗晚疫病的番茄品種，提高番茄產(chǎn)量具有重要意義，以及為其他植物的抗病性研究提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為過表達(dá)載體pBI-STTM-miR482a的物理圖譜；

圖2為轉(zhuǎn)STTM-miR482a番茄中miR482a的表達(dá)情況；

圖3為轉(zhuǎn)STTM-miR482a番茄離體葉片的抗病性檢測；

圖4為轉(zhuǎn)STTM-miR482a番茄植株的抗病性檢測。

具體實施方式