[發明專利]一種非小細胞肺癌全細胞抗原樹突狀細胞瘤苗的制備方法

在審

• 申請號: 201710170723.X
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106893696A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: 韋玉軍;陸寶石;李航;吳遠航;蘇軍
• 申請（專利權）人: 安徽安龍基因醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

技術領域

本發明屬于腫瘤免疫治療領域，具體涉及一種非小細胞肺癌全細胞抗原樹突狀細胞瘤苗的制備方法。

背景技術

肺癌發生于支氣管黏膜上皮，近50年來肺癌的發病率顯著增高，在歐美工業發達國家和我國的一些工業大城市中，肺癌發病率在男性惡性腫瘤中已居首位，在女性發病率也迅速增高，占女性常見惡性腫瘤的第2位或第3位。肺癌成為危害生命健康的一種主要疾病,肺癌通常分為兩種：非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)約占80±85％，小細胞肺癌(small cell carcinoma，SCC),約占15±20％。

非小細胞肺癌主要有三種亞型，包括腺癌(50％)、鱗癌(30％)、大細胞癌(5％),盡管手術、放療、化療的技術在不斷進步，但25年來，其五年期生存率也僅從5％提高到15％,因此開發一種新的治療方法也就尤為必要。

腫瘤疫苗是腫瘤生物治療的重要組成部分，近年來發展迅速，為腫瘤的預防和治療開辟了新的途徑,腫瘤疫苗原理是利用腫瘤抗原激發機體自身的免疫保護機制，達到全身性的特異性抗腫瘤作用,與現有治療方法相比，腫瘤疫苗毒副作用小，特異性高，作用范圍廣，在阻止腫瘤擴散，防止復發等方面逐漸展現出其功效。

樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是體內功能最強的抗原提呈細胞，能有效攝取、加工腫瘤抗原，表達高水平MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ類分子及CD54、CD80、CD86等多中共刺激分子，并分泌多種細胞因子如IL-12p70，誘導特異性細胞毒性T淋巴細胞，也促進了體液免疫，在機體抗腫瘤免疫中發揮著重要作用。

目前DC瘤苗負載的抗原主要有：腫瘤相關抗原肽(TAA)、腫瘤全細胞裂解物、凋亡細胞等,關于小細胞肺癌瘤苗制備方面，目前還主要在研究和探索階段，目前還未找到有效激發免疫應答的肺癌特異性抗原,因此選擇何種相關抗原并以何種手段刺激活化DC，從而增強患者免疫狀態，成為免疫治療的關鍵問題。體外研究表明，體外培養、擴增DC，并用腫瘤的裂解物致敏DC回輸體內，可有效誘發機體的特異性抗腫瘤免疫應答,該方法簡單易行，無需明確腫瘤抗原，回避了鑒定腫瘤特異性抗原的困難，可以激發針對多個已知或未知的腫瘤相關抗原的T細胞免疫，減少了腫瘤逃逸的可能性，且因其高表達MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子，同時啟動廣泛的Th1和CTL的免疫反應，可誘發多重免疫反應。

同時近年來研究發現，腫瘤細胞在熱休克過程中能大量產生熱休克蛋白(HSP70、HSP90、鈣網蛋白等)，HSP已被證明其作為一種免疫佐劑能有效地增強免疫反應,因此，經過熱休克的腫瘤細胞裂解物能更有效的致敏DC細胞,此外,研究表明，細菌脂多糖(LPS)刺激DC細胞后可增強DC細胞表面表達共刺激分子、促進其分泌細胞因子等，故其可以用來增強DC的抗原提成功能，增強免疫效應。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中的副作用大、效果比較差的缺陷，提供一種非小細胞肺癌全細胞抗原樹突狀細胞瘤苗的制備方法來解決上述問題。

本發明公開了一種非小細胞肺癌全細胞抗原樹突狀細胞瘤苗的制備方法，具體步驟為：

(一)、全細胞腫瘤抗原制備：

(1)、分別取對數生長期的小細胞肺癌細胞系H520和H522各2×10⁶個，懸浮于1ml PBS中，得到細胞懸液；

(2)、將細胞懸液置于40-43℃恒溫水浴鍋中，處理1h；

(3)、水浴鍋中取出細胞懸液，立即放到-75--85℃超低溫冰箱中，1h之后，轉入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，至完全融化，再次放入-75--85℃超低溫冰箱中，如此反復3次；

(4)、在12000rpm的條件下，離心10min；

(5)、取上清，即為熱休克腫瘤細胞凍融抗原，并用0.2μm孔徑過濾器過濾上清液，去除雜質后，將上清液置于-75--85℃超低溫冰箱中保存備用；

(二)、DC細胞制備：

(6)、取自體外周血100ml于血袋中，在無菌條件下分裝于含有15ml淋巴細胞分離液的離心管中，每管15ml，在2000rpm的條件下，離心15-25min；

(7)、離心結束后，吸取黃色透明層上的白膜層，再用生理鹽水重懸于50ml離心管中，離心3-8min，棄上清，如此反復兩次；

(8)、將細胞重懸于10ml的GT-T551培養基中，然后裝于T75培養瓶中，在37℃、5％CO₂飽和濕度培養箱中孵育2h；