[發(fā)明專利]一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710170723.X
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106893696A
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韋玉軍;陸寶石;李航;吳遠(yuǎn)航;蘇軍
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽安龍基因醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

1.一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，其特征在于：具體步驟為：

(一)、全細(xì)胞腫瘤抗原制備：

(1)、分別取對數(shù)生長期的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H520和H522各2×10⁶個，懸浮于1ml PBS中，得到細(xì)胞懸液；

(2)、將細(xì)胞懸液置于40-43℃恒溫水浴鍋中，處理1h；

(3)、水浴鍋中取出細(xì)胞懸液，立即放到-75--85℃超低溫冰箱中，1h之后，轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，至完全融化，再次放入-75--85℃超低溫冰箱中，如此反復(fù)3次；

(4)、在12000rpm的條件下，離心10min；

(5)、取上清，即為熱休克腫瘤細(xì)胞凍融抗原，并用0.2μm孔徑過濾器過濾上清液，去除雜質(zhì)后，將上清液置于-75--85℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

(二)、DC細(xì)胞制備：

(6)、取自體外周血100ml于血袋中，在無菌條件下分裝于含有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，每管15ml，在2000rpm的條件下，離心15-25min；

(7)、離心結(jié)束后，吸取黃色透明層上的白膜層，再用生理鹽水重懸于50ml離心管中，離心3-8min，棄上清，如此反復(fù)兩次；

(8)、將細(xì)胞重懸于10ml的GT-T551培養(yǎng)基中，然后裝于T75培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2h；

(9)、吸棄懸浮液，DC細(xì)胞貼壁，再加入40ml GT-T551培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)液；

(三)、DC瘤苗制備：

(10)、DC細(xì)胞培養(yǎng)第6天，將凍融抗原加入DC細(xì)胞中孵育4h；

(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小時，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；

(12)、在上述細(xì)胞液中加入LPS，使?jié)舛葹?μg/ml，孵育24h，以增強DC細(xì)胞表達共刺激分子，分泌IL-12p70；

(13)、第8天，細(xì)胞刮子從培養(yǎng)瓶底部刮起腫瘤細(xì)胞，收集到50ml離心管中，2000rpm，5min離心；

(14)、棄上清，并重懸上述DC細(xì)胞于生理鹽水中，離心3-8min，棄上清，重復(fù)兩次，即制成負(fù)載全細(xì)胞抗原的DC瘤苗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟(7)中，離心速度為1500rpm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟(8)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素和50μg/ml的兩性霉素B。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟(9)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素、5％(v/v)滅活人AB血清、50μg/ml兩性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟(10)中，DC細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的濃度比在5:1-10:1之間，其中凍融抗原H520:H522＝1:1。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟(14)中，離心速度為1500rpm。