[發明專利]一種基于熔解曲線法單管同時檢測副流感病毒和冠狀病毒的引物及其應用

在審

• 申請號: 201710169042.1
• 申請日: 2017-03-21
• 公開（公告）號: CN106868213A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 任緒義;虞閏六;羅英;金亞南
• 申請（專利權）人: 重慶迪安醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 丁靜靜,肖明芳

技術領域

本發明涉及核酸檢測技術領域，具體涉及一種基于熒光探針熔解曲線法同時檢測7種呼吸道病毒的引物及其應用。這7種病毒包括：副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III(PIV3)、冠狀病毒229E(CV229E)、冠狀病毒OC43(CVOC43)、冠狀病毒NL63(CVNL63)、冠狀病毒HKU1(CVHKU1)。

背景技術

急性呼吸道感染是臨床最常見的疾病之一，可以在任何性別、年齡和地域發生，尤其在老年人和嬰幼兒中有較高的發病率和死亡率，嚴重影響人的身體健康，給社會帶來嚴重的經濟損失。僅20世紀，全球就有超過1億人因感染流感病毒而死亡。近年來，禽流感、SARS病毒、甲型H1N1接連在全球部分地區大范圍蔓延，給公共衛生安全造成很大的危害。急性呼吸道感染可由細菌、病毒和支原體感染引起。呼吸道病毒是其中主要病原體，至少有7個科，10多類，共239個型別的病毒可引起急性呼吸道感染。由于病毒顆粒小，容易通過呼吸道進行傳播，且傳播速度快，容易造成大流行。另外病毒容易發生突變，產生新的高致病性病原體，感染力增強，混合感染率的概率提高。不同呼吸道病毒所引發的癥狀和流行特點相似，臨床上難以區分從而進行準確診治。因此，準確鑒定呼吸道病毒的病原體對于制定治療和用藥方案、控制呼吸道病毒的傳播具有重要意義。

對于呼吸道病毒感染的診斷，其常用的檢測方法有以下幾種：1、病毒分離培養法，是病毒診斷的“金標準”，缺點：費時費力，且需要有經驗操作者；生物安全風險較高。2、免疫學檢查，是臨床門診檢驗常用的方法，該方法操作簡單、快速、費用低，但靈敏度特異性不高，病毒抗原發生變異時出現假陰性結果，且一個檢測只能針對其中一種病原體。3、分子生物學方法，其優點是：靈敏度高，特異性強，但目前采用的普通熒光PCR檢測一般一次只能檢測一種病毒，通過重復多次實現對所有病原體的檢測，而多通道熒光檢測單管最多只能檢測3-5個，無法滿足一次進行多種病原體的檢測。由此可見目前急需一種靈敏、特異、快速、簡便的呼吸道病毒的多病原體檢測的方法，以便能滿足臨床診斷、衛生防疫、傳染病流行病學研究的需要。

Tem-PCR(Target enriched multiplex PCR靶序列富集多重PCR技術)是一種多重PCR技術，能在一次反應中對多種靶序列進行擴增和檢測，本發明基于Tem-PCR技術，經熒光分子信標檢測通過Tm值分析來實現對多種病原體的同時檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種同時擴增和檢測多種呼吸道病毒的引物、探針，以解決現有技術中要針對不同病毒多次重復實驗的問題。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種基于熔解曲線法單管同時檢測副流感病毒和冠狀病毒的引物，包括如下引物：SEQ ID NO.：1～7所示的反轉錄引物、SEQ ID NO.：8～21所示的擴增引物、SEQ ID NO.：22～23所示的啟動擴增的通用引物、SEQ ID NO.：24～30所述的分子信標探，所述分子信標探針的兩端分別帶有熒光基團和猝滅基團。

其中，所述的副流感病毒包括副流感病毒I型、副流感病毒II型、副流感病毒III；所述的冠狀病毒包括：冠狀病毒229E、冠狀病毒OC43、冠狀病毒NL63、冠狀病毒HKU1。

其中，所述熒光基團包括FAM、HEX、Cy5，所述淬滅基團為DABCYL。

上述基于熔解曲線法單管同時檢測副流感病毒和冠狀病毒的引物在檢測副流感病毒和冠狀病毒中的應用在本發明的保護范圍之內。

其中，檢測時所述所述通用引物在擴增體系中的終濃度為0.1uM；所述擴增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物濃度為0.02uM，所述下游引物濃度為0.2uM；分子信標探針濃度為0.2uM。

其中，所述檢測是基于Tem-PCR的熔解曲線分析，具體程序如下：

熱啟動：95℃15min；

富集階段：94℃30s，52℃1min，72℃1min 15循環；

加尾擴增：94℃15s，70℃1.5min(6cycles)；

PCR擴增：94℃15s，52℃15s，72℃15s 55循環；

延伸階段：72℃3min；

熔解分析：95℃1min，37℃5min，80℃—30℃0.1℃/s。